Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Voafetra ny fanohanana CSS amin'ny dikan-tranonkala ampiasainao. Ho an'ny vokatra tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa dikan-tranonkala vaovao kokoa (na hanafoana ny Compatibility Mode ao amin'ny Internet Explorer). Mandritra izany fotoana izany, mba hahazoana antoka fa mitohy ny fanohanana, dia asehoy ny tranonkala tsy misy endrika na JavaScript.
Ny fahitana sy ny fampiasana mahasoa ny vokatra voajanahary dia afaka manampy amin'ny fanatsarana ny fiainan'ny olombelona. Ny akora simika manakana ny fitomboan'ny zavamaniry dia ampiasaina betsaka ho toy ny herbicide mba hifehezana ny ahidratsy. Noho ny filàna fampiasana karazana herbicide samihafa, dia ilaina ny mamantatra ireo singa misy fomba fiasa vaovao. Ato amin'ity fandalinana ity, dia nahita singa N-alkoxypyrrole vaovao izahay, coumamonamide, avy amin'ny Streptomyces werraensis MK493-CF1 ary nametraka ny dingana feno amin'ny fananganana. Tamin'ny alàlan'ny fanadihadiana momba ny asa biolojika, dia hitanay fa ny asidra urs-monoamika dia mpanelanelana sentetika amin'ny urs-monoamide ary mety ho...mpanakana ny fitomboan'ny zavamaniryAnkoatra izany, dia namorona karazana asidra urbenônika isan-karazany izahay, anisan'izany ny urbenyloxy derivative (UDA), izay manana hetsika famonoana ahi-dratsy avo lenta nefa tsy misy fiantraikany ratsy amin'ny fitomboan'ny sela HeLa. Hitanay ihany koa fa ny asidra urmotonic dia manakorontana ny microtubules amin'ny zavamaniry; ankoatra izany, ny KAND dia misy fiantraikany amin'ny filaments actin ary miteraka fahafatesan'ny sela; Ireo fiantraikany maro samihafa ireo dia tsy mitovy amin'ny an'ny inhibitors microtubule fantatra ary manolotra fomba fiasa vaovao ho an'ny asidra ursonic, izay maneho tombony lehibe amin'ny fampivoarana herbicides vaovao.
Ny fahitana sy ny fampiharana azo ampiharina ny vokatra voajanahary mahasoa sy ny vokatra azo avy amin'izany dia fomba iray hanatsarana ny kalitaon'ny fiainan'olombelona. Ny metabolites faharoa vokarin'ny zavamananaina bitika, zavamaniry ary bibikely dia nitarika fandrosoana lehibe teo amin'ny fitsaboana sy ny fambolena. Maro ny antibiotika sy fanafody manohitra ny leukemia no novolavolaina avy amin'ny vokatra voajanahary. Ankoatra izany, karazana fanafody isan-karazanyfanafody famonoana bibikely, ny fungicide sy ny herbicide dia nalaina avy amin'ireo vokatra voajanahary ireo mba hampiasaina amin'ny fambolena. Indrindra indrindra, ny herbicide fanaraha-maso ny ahi-dratsy dia fitaovana manan-danja amin'ny fampitomboana ny vokatra amin'ny fambolena maoderina, ary karazana akora isan-karazany no efa ampiasaina ara-barotra. Dingana sela maromaro ao amin'ny zavamaniry, toy ny photosynthesis, metabolisman'ny asidra amine, fananganana rindrin'ny sela, fandrindrana ny mitosis, famantarana phytohormone, na fananganana proteinina, no heverina ho lasibatra mahazatra amin'ny herbicide. Ny akora izay manakana ny fiasan'ny microtubule dia kilasy mahazatra amin'ny herbicide izay misy fiantraikany amin'ny fitomboan'ny zavamaniry amin'ny alàlan'ny fiantraikany amin'ny fandrindrana ny mitotic2.
Singa ao amin'ny cytoskeleton ny mikrôtubula ary voatahiry betsaka ao amin'ny sela eukaryotic. Ny heterodimer an'ny tubulin dia ahitana α-tubulin sy β-tubulin izay mamorona protofilaments microtubule linear, miaraka amin'ny protofilaments 13 izay mamorona rafitra boribory. Mitana anjara toerana maro ao amin'ny sela zavamaniry ny mikrôtubula, anisan'izany ny famaritana ny endriky ny sela, ny fizarazaran'ny sela, ary ny fitaterana intracellular3,4. Ny sela zavamaniry dia misy mikrôtubula eo ambanin'ny fonon'ny plasma interphase, ary ireo antsoina hoe mikrôtubula cortical ireo dia heverina fa mifehy ny fandaminana ny mikrôfibrila cellulose amin'ny alàlan'ny fanaraha-maso ny complexes cellulose synthase4,5. Ny mikrôtubula cortical an'ny sela epidermal amin'ny faka, izay hita ao amin'ny faritra misy ny fanitarana haingana ny tendron'ny faka, dia hita eo amin'ny sisiny, ary ny mikrôfibera cellulose dia manaraka ireo mikrôtubula ireo ary mametra ny lalana itarihan'ny sela, ka mampiroborobo ny fanitarana ny sela anisotropic. Noho izany, ny asan'ny mikrôtubula dia mifandray akaiky amin'ny morphology zavamaniry. Ny fanoloana asidra amine ao amin'ny fototarazo izay mandrindra ny tubuline dia miteraka fiolahana eo amin'ny filaharan'ny microtubule cortical sy fitomboana amin'ny lafiny havia na havanana ao amin'ny Arabidopsis 6,7. Toy izany koa, ny fiovan'ny proteinina mifandraika amin'ny microtubule izay mandrindra ny dinamikan'ny microtubule dia mety hiteraka fitomboan'ny faka miolakolaka ihany koa8,9,10,11,12,13. Ankoatra izany, ny fitsaboana amin'ny herbicide manelingelina ny microtubule toy ny disopyramide, fantatra ihany koa amin'ny hoe pretilachlor, dia miteraka fitomboan'ny faka miolakolaka amin'ny lafiny havia14. Ireo angon-drakitra ireo dia manondro fa ny fandrindrana mazava tsara ny asan'ny microtubule dia tena ilaina amin'ny famaritana ny lalana izoran'ny fitomboan'ny zavamaniry.
Karazana fanafody manakana ny fiforonan'ny sela ao amin'ny vatana (microtubule inhibitors) no hita, ary ireo fanafody ireo dia nandray anjara betsaka tamin'ny fikarohana momba ny sela ao amin'ny vatana, ary koa tamin'ny fambolena sy ny fitsaboana2. Indrindra indrindra, ny oryzalin, ny fitambaran'ny dinitroaniline, ny disopyramide, ny fitambaran'ny benzamide, ary ny analogies azy ireo dia afaka manakana ny fiasan'ny microtubule ary noho izany dia manakana ny fitomboan'ny zavamaniry. Noho izany, ampiasaina betsaka ho fanafody famonoana bibikely izy ireo. Na izany aza, satria singa manan-danja amin'ny sela zavamaniry sy biby ny microtubule, ny ankamaroan'ny fanafody manakana ny fiforonan'ny sela dia misy poizina ho an'ny karazana sela roa. Noho izany, na dia fantatra aza fa mahasoa azy ireo ho fanafody famonoana bibikely, dia voafetra ny isan'ny fanafody manohitra ny microtubule ampiasaina amin'ny tanjona azo ampiharina.
Ny Streptomyces dia karazana iray ao amin'ny fianakaviana Streptomyces, izay ahitana bakteria aerobika, gram-positive, ary kofehy ary fantatra betsaka amin'ny fahaizany mamokatra karazana metabolites faharoa isan-karazany. Noho izany, heverina ho iray amin'ireo loharano manan-danja indrindra amin'ny vokatra voajanahary vaovao mavitrika ara-biolojika izy io. Tao amin'ny fanadihadiana ankehitriny, dia nahita fitambarana vaovao antsoina hoe coumamonamide izahay, izay nalaina avy amin'ny Streptomyces werraensis MK493-CF1 sy S. werraensis ISP 5486. Tamin'ny fampiasana fanadihadiana spectral sy fanadihadiana spectral feno, dia nojerena ny firafitry ny coumamonamide ary voafaritra ny taolany N-alkoxypyrrole miavaka. Ny asidra Ursmonika, mpanelanelana sentetika amin'ny ursmonoamide sy ny derivatives, dia hita fa manakana ny fitomboana sy ny fitsimohan'ny zavamaniry modely malaza Arabidopsis thaliana. Tao amin'ny fanadihadiana momba ny fifandraisan'ny rafitra sy ny asa, dia hitanay fa ny fitambarana misy C9 novaina ho asidra ursonic, antsoina hoe nonyloxy derivative of ursonic acid (KAND), dia mampitombo be ny fiantraikany manakana ny fitomboana sy ny fitsimohan'ny zavamaniry. Tsara homarihina fa ny inhibitoran'ny fitomboan'ny zavamaniry vao hita dia nisy fiantraikany tamin'ny fitomboan'ny paraky sy ny aty ary tsy misy poizina ho an'ny bakteria na ny sela HeLa. Ankoatra izany, ny sasany amin'ireo derivatives amin'ny asidra urmotonic dia miteraka phenotype fakany miolikolika, izay midika fa ireo derivatives ireo dia misy fiantraikany mivantana na ankolaka amin'ny microtubules. Mifanaraka amin'io hevitra io, ny fandinihanay ny microtubules voamarika na immunohistochemical na miaraka amin'ny proteinina fluorescent dia manondro fa ny fitsaboana KAND dia manala ny polymerization ny microtubules. Ankoatra izany, ny fitsaboana amin'ny derivatives amin'ny asidra kumamotonic dia manakorontana ny microfilaments actin. Noho izany, nahita inhibitoran'ny fitomboan'ny zavamaniry vaovao izahay izay ny mekanisma miavaka amin'ny fiasany dia ny fandringanana ny cytoskeleton.
Nalaina avy amin'ny tany tao Shinagawa-ku, Tokyo ny karazana MK493-CF1. Ny karazana MK493-CF1 dia namorona mycelium stromal misampana tsara. Voafaritra ny filaharan'ny ampahany amin'ny gène RNA ribosomal 16S (1422 bp). Mitovy be amin'ny S. werraensis ity karazana ity (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: karazana mahazatra, 99.93%). Mifototra amin'io valiny io, dia voafaritra fa mifandray akaiky amin'ny karazana karazana S. werraensis ity karazana ity. Noho izany, dia nomenay anarana vonjimaika hoe S. werraensis MK493-CF1 ity karazana ity. Ny S. werraensis ISP 5486T koa dia mamokatra ireo akora bioactive mitovy. Koa satria vitsy ny fikarohana tany am-boalohany momba ny fahazoana vokatra voajanahary avy amin'ity zavamananaina bitika ity, dia nisy fikarohana simika fanampiny natao. Rehefa avy nambolena ny S. werraensis MK493-CF1 tamin'ny tany orza tamin'ny alalan'ny fermentation solid-state tamin'ny 30°C nandritra ny 14 andro, dia nalaina tamin'ny EtOH 50% ny tany. Nohamainina ny santionany 60 ml mba hahazoana 59.5 mg ny nalaina manta. Nampiharina tamin'ny HPLC dingana mivadika ny nalaina manta mba hahazoana N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, antsoina hoe coumamonamide, 36.0 mg). Ny fitambaran'ny 1 dia eo amin'ny 60% eo ho eo amin'ny nalaina manta. Noho izany, nanapa-kevitra ny handalina amin'ny antsipiriany ny toetran'ny kumamotoamide 1 izahay.
Vovoka fotsy tsy misy endrika ny Coumamonamide 1 ary ny spektrometria faobe avo lenta (HRESIMS) dia manamafy ny C6H8N2O2 (Sary 1). Ny sombin-pyrrole nosoloina C2 amin'ity fitambarana ity dia miavaka amin'ny δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH amin'ny spectrum 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) ary δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), ary ny spectrum 13C NMR dia mampiseho ny fisian'ny atôma karbônina sp2 efatra. Ny fisian'ny vondrona amide eo amin'ny toerana C2 dia nojerena tamin'ny alalan'ny fifandraisana HMBC avy amin'ny prôtôna C-3 mankany amin'ny karbônina karbônina amide eo amin'ny δC 161.1. Ankoatra izany, ny tampon'ny 1 H sy 13 C NMR amin'ny δH 4.10 (3H, S) sy δC 68.3 dia manondro ny fisian'ny vondrona N-methoxy ao amin'ny molekiola. Na dia mbola tsy voafaritra aza ny toerana marina misy ny vondrona methoxy amin'ny alàlan'ny fanadihadiana spectroscopic toy ny enhanced difference spectroscopy sy ny nuclear Overhauser abbreviation (NOEDF), ny N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide no lasa singa voalohany.
Mba hamaritana ny firafitry ny 1 marina, dia nisy synthesis manontolo natao (Sary 2a). Ny fitsaboana ny 2-aminopyridine 2 azo vidiana eny an-tsena amin'ny m-CPBA dia nahatonga ny N-oxide 3 mifanaraka amin'izany amin'ny vokatra quantitative. Taorian'ny 2-aminoazidation an'ny 2, ny fihetsiky ny cyclocondensation nolazain'i Abramovich dia natao tao amin'ny benzene tamin'ny 90°C mba hahazoana ny 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 irina amin'ny grama. Hafainganam-pandeha 60% (dingana roa). 15,16. Ny methylation sy ny hydrolysis an'ny 4 dia nanome asidra 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic (antsoina hoe "asidra cumotonic", 6) tamin'ny vokatra tsara (70%, dingana roa). Farany, ny amidation amin'ny alàlan'ny asidra klôro intermediate 6 mampiasa amoniaka aqueous dia nanome Kumamoto amide 1 tamin'ny vokatra 98%. Ny angon-drakitra spectral rehetra an'ny 1 voafintina dia mitovy amin'ny 1 mitokana, ka voafaritra ny firafitry ny 1;
Famoronana sy famakafakana ankapobeny ny asa biolojikan'ny urbenamide sy ny asidra urbenika. (a) Famoronana manontolo ny Kumamoto amide. (b) Ireo zana-kazo Arabidopsis Columbia (Col) karazana dia fito andro dia novolena tamin'ny takelaka Murashige sy Skoog (MS) misy coumamonamide 6 na coumamonamide 1 amin'ny fifantohana voalaza. Bara mizana = 1 cm.
Voalohany, nodinihinay ny fiasan'ny urbenamide sy ireo akora mpanelanelana ao aminy mba handrefesana ny fahafahan'izy ireo manova ny fitomboan'ny zavamaniry. Nanampy fifantohana ursmonamide 1 na asidra ursmonic 6 isan-karazany izahay tamin'ny medium MS agar ary zana-kazo Arabidopsis thaliana novolena tamin'ity medium ity. Ireo fanadihadiana ireo dia naneho fa ny fifantohana avo lenta (500 μM) amin'ny 6 dia nanakana ny fitomboan'ny faka (Sary 2b). Avy eo, namorona derivatives isan-karazany izahay tamin'ny fanoloana ny toerana N1 amin'ny 6 ary nanao fandalinana ny fifandraisan'ny rafitra sy ny asa tamin'izy ireo (ny dingana fananganana analogue dia voalaza ao amin'ny Supporting Information (SI)). Nambolena tamin'ny medium misy derivatives asidra ursonic 50 μM ny zana-kazo Arabidopsis, ary norefesina ny halavan'ny faka araka ny aseho amin'ny sary. Araka ny aseho amin'ny Sary 3a, b, ary S1, ny asidra coumamo dia manana halavan'ny rojo alkoxy linear (9, 10, 11, 12, ary 13) na rojo alkoxy lehibe (15, 16, ary 17) samihafa amin'ny toerana N1. Nasehon'ireo vokatra azo avy amin'izany fa nisy fiantraikany lehibe teo amin'ny fitomboan'ny faka. Ankoatra izany, hitanay fa ny fampiharana 200 μM 10, 11, na 17 dia nanakana ny fitsimohan'ny faka (Sary 3c sy S2).
Fandinihana ny fifandraisan'ny rafitra sy ny asan'ny Kumamoto amide sy ireo akora mifandraika amin'izany. (a) Tetikasa rafitra sy fandrafetana ny analogies. (b) Fandrefesana ny halavan'ny fakany zana-kazo 7 andro ambolena amin'ny medium MS miaraka na tsy misy 50 μM coumamonamide derivatives. Ny kintana dia manondro fahasamihafana manan-danja amin'ny fitsaboana sandoka (t test, p< 0.05). n>18. Aseho amin'ny salan'isa ± SD ny angon-drakitra. Ny nt dia midika hoe "tsy nosedraina" satria mihoatra ny 50% amin'ireo voa no tsy nitsimoka. (c) Fandrefesana ny tahan'ny fitsimohan'ireo voa notsaboina notehirizina nandritra ny 7 andro tao anaty fitaovana MS miaraka na tsy misy coumamonamide 200 μM sy akora mifandraika amin'izany. Ny kintana dia manondro fahasamihafana manan-danja amin'ny fitsaboana sandoka (fitsapana chi-square). n=96.
Mahaliana fa ny fanampiana rojo alkyl lava kokoa noho ny C9 dia nampihena ny fiasan'ny fanakanana, izay manondro fa ireo singa mifandraika amin'ny asidra kumamotoika dia mitaky rojo ambioka amin'ny habe iray mba hampisehoana ny asany biolojika.
Satria ny fanadihadiana momba ny fifandraisan'ny rafitra sy ny asa dia naneho fa ny C9 dia novaina ho asidra ursonic ary ny nonyloxy derivative an'ny asidra ursonic (antsoina eto ambany hoe KAND 11) no mpanakana ny fitomboan'ny zavamaniry mahomby indrindra, dia nanao famaritana amin'ny antsipiriany kokoa momba ny KAND 11 izahay. Ny fitsaboana ny Arabidopsis amin'ny 50 μM KAND 11 dia saika nisakana tanteraka ny fitsimohany, raha ny fifantohana ambany kokoa (40, 30, 20, na 10 μM) amin'ny KAND 11 kosa dia nanakana ny fitomboan'ny faka amin'ny fomba miankina amin'ny fatra (Sary 4a, b). Mba hitsapana raha misy fiantraikany amin'ny fahaveloman'ny meristem faka ny KAND 11, dia nodinihinay ny meristem faka nolokoina tamin'ny propidium iodide (PI) ary norefesinay ny haben'ny velaran'ny meristem. Ny haben'ny meristem an'ireo zana-kazo ambolena amin'ny fitaovana misy KAND-11 25 μM dia 151.1 ± 32.5 μm, raha toa kosa ny haben'ny meristem an'ireo zana-kazo ambolena amin'ny fitaovana fanaraha-maso misy DMSO dia 264.7 ± 30.8 μm (Sary 4c, d), izay midika fa ny KAND-11 dia mamerina amin'ny laoniny ny asan'ny sela. fiparitahana. meristem faka. Mifanaraka amin'izany, ny fitsaboana KAND 11 dia nampihena ny habetsaky ny mari-pamantarana fizarazarana sela CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ao amin'ny meristem faka (Sary 4e) 17. Ireo valiny ireo dia manondro fa ny KAND 11 dia manakana ny fitomboan'ny faka amin'ny alàlan'ny fampihenana ny asan'ny fiparitahan'ny sela.
Famakafakana ny fiantraikan'ny asidra urbenônika (urbenyloxy derivatives) manakana ny fitomboana. (a) Zana-kazo Col karazana dia 7 andro novolena tamin'ny takelaka MS miaraka amin'ny fifantohana KAND 11 voalaza. Bara mizana = 1 sm. (b) Fandrefesana ny halavan'ny faka. Ny litera dia manondro fahasamihafana manan-danja (fitsapana Tukey HSD, p< 0.05). n>16. Aseho amin'ny salan'isa ± SD ny angon-drakitra. (c) Mikroskôpia confocal an'ny fakany Col karazana voajanahary voaloko propidium iodide izay ambolena amin'ny takelaka MS misy na tsy misy 25 μM KAND 11. Fononteny fotsy dia manondro ny meristem faka. Bara mizana = 100 µm. (d) Fandrefesana ny haben'ny meristem faka (n = 10 hatramin'ny 11). Ny fahasamihafana ara-statistika dia voafaritra tamin'ny fampiasana t-test (p< 0.05). Ireo bara ireo dia maneho ny haben'ny meristem antonony. (e) Mikroskôpia DIC (Differential interference contrast) amin'ny meristem faka misy ny CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS voaloko sy voaloko tamin'ny zana-kazo 5 andro nambolena tamin'ny takelaka MS miaraka na tsy misy fitsapana KAND 25 µM.
Notsapaina bebe kokoa ny poizina ateraky ny KAND 11 amin'ny alalan'ny fampiasana zavamaniry dicotyledonous hafa, dia ny paraky (Nicotiana tabacum), sy ny zavamananaina modely lehibe amin'ny zavamaniry an-tanety, ny liverwort (Marchantia polymorpha). Toy ny amin'ny Arabidopsis, ny zana-paraky SR-1 nambolena tamin'ny tany misy 25 μM KAND 11 dia namokatra faka fohy kokoa (Sary 5a). Fanampin'izany, 40 amin'ireo voa 48 no nitsimoka tamin'ny takelaka misy 200 μM KAND 11, raha toa kosa ireo voa 48 rehetra nitsimoka tamin'ny tany notsaboina tamin'ny fomba sandoka, izay midika fa ny fifantohana KAND ambony kokoa dia manan-danja (p< 0.05; fitsapana chi -square) dia nanakana ny fitsimohan'ny paraky. (Sary 5b). Ankoatra izany, ny fifantohana KAND 11 izay nanakana ny fitomboan'ny bakteria tao amin'ny liverwort dia mitovy amin'ny fifantohana mahomby ao amin'ny Arabidopsis (Sary 5c). Ireo valiny ireo dia manondro fa ny KAND 11 dia afaka manakana ny fitomboan'ny karazana zavamaniry isan-karazany. Avy eo dia nodinihinay ny mety ho fiantraikan'ny singa mifandraika amin'ny bera monoamide amin'ny zavamananaina hafa, dia ny sela HeLa olombelona sy ny karazana Escherichia coli DH5α, izay solontenan'ny sela biby sy bakteria ambony kokoa. Tao anatin'ny andiana fanadihadiana momba ny fihanaky ny sela, dia hitanay fa ny coumamonamide 1, ny asidra coumamonamidic 6, ary ny KAND 11 dia tsy nisy fiantraikany tamin'ny fitomboan'ny sela HeLa na E. coli tamin'ny fifantohana 100 μM (Sary 5d, e).
Fanakanana ny fitomboan'ny KAND 11 amin'ny zavamananaina tsy Arabidopsis. (a) Ireo zana-paraky SR-1 karazana dia roa herinandro dia novolena tamin'ny takelaka MS napetraka mitsangana misy KAND 11 25 μM. (b) Ireo zana-paraky SR-1 karazana dia roa herinandro dia novolena tamin'ny takelaka MS napetraka mitsivalana misy KAND 11 200 μM. (c) Ireo tsimok'aretin'ny aty Tak-1 karazana dia roa herinandro novolena tamin'ny takelaka Gamborg B5 miaraka amin'ny fifantohana KAND 11 voalaza. Ny zana-tsipìka mena dia manondro spores izay nijanona tsy nitombo tao anatin'ny fe-potoana fikorianan'ny sela roa herinandro. (d) Famakafakana ny fihanaky ny sela amin'ny sela HeLa. Ny isan'ny sela velona dia norefesina tamin'ny elanelam-potoana raikitra tamin'ny fampiasana kitapo fanisana sela 8 (Dojindo). Amin'ny maha-fanaraha-maso azy, ny sela HeLa dia notsaboina tamin'ny actinomycin D (Act D) 5 μg/ml, izay manakana ny fandikana ny RNA polymerase ary miteraka fahafatesan'ny sela. Natao intelo ny fanadihadiana. (e) Famakafakana ny fihanaky ny sela E. coli. Nohadihadiana tamin'ny fandrefesana ny OD600 ny fitomboan'ny E. coli. Ho fanaraha-maso, ireo sela dia notsaboina tamin'ny ampicillin (Amp) 50 μg/ml, izay manakana ny fananganana rindrin'ny sela bakteria. Natao intelo ny fanadihadiana.
Mba hamakiana ny fomba fiasan'ny cytotoxicity vokatry ny akora mifandraika amin'ny uramide, dia nohadihadianay indray ireo akora avy amin'ny asidra urbenika izay manana fiantraikany manakana antonony, araka ny aseho amin'ny sary. Araka ny aseho amin'ny Sary 2b, 6a, ireo zana-kazo nambolena tamin'ny takelaka agar misy fifantohana avo lenta (200 μM) amin'ny asidra urmotonic 6 dia namokatra faka fohy kokoa sy miolikolika havia (θ = – 23.7 ± 6.1), raha toa kosa ireo zana-kazo nambolena tamin'ny fitaovana fanaraha-maso, dia namokatra faka mahitsy (θ = – 3.8 ± 7.1). Ity fitomboana miolikolika mampiavaka ity dia fantatra fa vokatry ny tsy fahatomombanan'ny microtubules cortical14,18. Mifanaraka amin'io zavatra hita io, ireo fanafody manimba ny microtubule disopyramide sy oryzalin dia niteraka fiolahana mitovy amin'ny faka teo ambanin'ny toe-javatra fitomboanay (Sary 2b, 6a). Nandritra izany fotoana izany ihany, dia notsapainay ireo akora avy amin'ny asidra urmotonic ary nofantenanay ny maromaro tamin'izy ireo izay, amin'ny fifantohana sasany, dia niteraka fitomboan'ny faka miolikolika. Ny fitambarana 8, 9, ary 15 dia nanova ny lalan'ny fitomboan'ny faka amin'ny 75 μM, 50 μM, ary 40 μM tsirairay avy, izay manondro fa ireo fitambarana ireo dia afaka manimba tanteraka ny microtubules (Sary 2b, 6a). Notsapainay ihany koa ny derivative asidra ursolic mahery indrindra, KAND 11, amin'ny fifantohana ambany kokoa (15 µM) ary hitanay fa ny fampiharana ny KAND 11 dia nanakana ny fitomboan'ny faka ary tsy mitovy ny lalan'ny fitomboan'ny faka, na dia mirona hidina miankavia aza izy ireo (Sary C3). Satria ny fifantohana ambony kokoa amin'ny fanafody manimba ny microtubules indraindray dia manakana ny fitomboan'ny zavamaniry fa tsy miteraka fiolahana amin'ny faka, dia nanombana ny mety hisian'ny fiantraikan'ny KAND 11 amin'ny microtubules amin'ny fandinihana ny microtubules cortical ao amin'ny sela epidermal amin'ny faka. Ny immunohistochemistry mampiasa anti-β-tubulin antibody ao amin'ny sela epidermal amin'ny fakany zana-kazo izay notsaboina tamin'ny 25 μM KAND 11 dia naneho ny fanjavonan'ny microtubules cortical rehetra ao amin'ny sela epidermal ao amin'ny faritra elongation (Sary 6b). Ireo valiny ireo dia manondro fa ny asidra kumamotonika sy ireo zavatra avy aminy dia miasa mivantana na ankolaka amin'ny mikrôtubula mba hanakorontanana azy ireo, ary ireo singa ireo dia mpanakana ny mikrôtubula vaovao.
Ny asidra ursonic sy ireo vokatra azo avy aminy dia manova ny microtubules cortical ao amin'ny Arabidopsis thaliana. (a) Zoro fironan'ny faka voarefy eo anatrehan'ny vokatra azo avy amin'ny asidra urmotonic isan-karazany amin'ny fifantohana voalaza. Nodinihina ihany koa ny vokatry ny akora roa fantatra fa manakana ny microtubules: disopyramide sy oryzalin. Ny sary kely dia mampiseho ny fenitra ampiasaina handrefesana ny zoro fitomboan'ny faka. Ny kintana dia manondro fahasamihafana manan-danja amin'ny fitsaboana sandoka (t test, p< 0.05). n>19. Bara mizana = 1 sm. (b) Microtubules cortical ao amin'ny sela epidermal ao amin'ny faritra elongation. Ny Microtubules amin'ny fakany Arabidopsis Col karazana wild-type izay nambolena tamin'ny takelaka MS misy na tsy misy 25 μM KAND 11 dia nojerena tamin'ny alàlan'ny fandokoana immunohistochemical mampiasa antibody voalohany β-tubulin sy antibody faharoa Alexa Fluor-conjugated. Bara mizana = 10 µm. (c) Rafitra mitotic an'ny microtubules ao amin'ny meristem faka. Ny Microtubules dia nojerena tamin'ny alàlan'ny fandokoana immunohistochemical. Ny rafitra mitotic, anisan'izany ny faritra prophase, spindle, ary phragmoplasts, dia nisaina avy amin'ny sary confocal. Ny zana-tsipìka dia manondro ny rafitra microtubule mitotic. Ny kintana dia manondro fahasamihafana manan-danja amin'ny fitsaboana sandoka (t test, p< 0.05). n>9. Bara mizana = 50 µm.
Na dia manana fahafahana manakorontana ny fiasan'ny microtubule aza ny Ursa, dia antenaina fa tsy hitovy amin'ny akora mpanala polymerizer microtubule mahazatra ny fomba fiasany. Ohatra, ny fifantohana ambony kokoa amin'ny akora mpanala polymerizer microtubule toy ny disopyramide sy oryzalin dia miteraka fanitarana anisotropic ny sela epidermal, raha toa kosa ny KAND 11 tsy manao izany. Ankoatra izany, ny fampiharana miaraka ny KAND 11 sy ny disopyramide dia niafara tamin'ny fitomboan'ny faka vokatry ny disopyramide ary hita fa nisy fanakanana ny fitomboana vokatry ny KAND 11 (Sary S4). Nodinihinay ihany koa ny fihetsiky ny mutant disopyramide 1-1 (phs1-1) hypersensitive amin'ny KAND 11. Ny phs1-1 dia manana fiovan'ny teboka kinase tubulin tsy kanonika ary mamokatra faka fohy kokoa rehefa tsaboina amin'ny disopyramide9,20. Ny zana-ketsa mutant phs1-1 ambolena amin'ny medium agar misy KAND 11 dia nanana faka fohy kokoa mitovy amin'ny ambolena amin'ny disopyramid (sary S5).
Ankoatra izany, nahita rafitra microtubule mitotic izahay, toy ny faritra prophase, spindle, ary phragmoplasts, tao amin'ny meristem fakany tamin'ny zana-kazo notsaboina tamin'ny KAND 11. Mifanaraka amin'ny fandinihana ny CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, dia nahitana fihenana be teo amin'ny isan'ny microtubule mitotic (Sary .6c).
Mba hamaritana ny cytotoxicity an'ny KAND 11 amin'ny resolution subcellular, dia notsaboinay tamin'ny KAND 11 ny sela mihantona BY-2 paraky ary nojerenay ny fihetsiny. Nampidirinay voalohany tao amin'ny sela BY-2 maneho TagRFP-TUA6 ny KAND 11, izay manisy marika fluorescent amin'ny microtubules, mba hanombanana ny fiantraikan'ny KAND 11 amin'ny microtubules cortical. Notombanana tamin'ny alalan'ny fanadihadiana sary ny hakitroky ny microtubules cortical, izay nandrefesana ny isan-jaton'ny pixel cytoskeletal eo amin'ireo pixel cytoplasmic. Ny valin'ny fanadihadiana dia naneho fa rehefa avy notsaboina tamin'ny 50 μM na 100 μM KAND 11 nandritra ny 1 ora, dia nihena be ny hakitroky ho 0.94 ± 0.74% na 0.23 ± 0.28%, tsirairay avy, raha toa kosa ka 1.61 ± 0.34% ny hakitroky ny sela notsaboina tamin'ny DMSO (Sary 7a). Ireo valiny ireo dia mifanaraka amin'ny fandinihana tao amin'ny Arabidopsis fa ny fitsaboana KAND 11 dia miteraka depolymerization ny microtubules cortical (Sary 6b). Nodinihinay ihany koa ny tsipika BY-2 miaraka amin'ny kofehy actin misy marika GFP-ABD taorian'ny fitsaboana tamin'ny fifantohana mitovy amin'ny KAND 11 ary nahita izahay fa ny fitsaboana KAND 11 dia nanimba ny kofehy actin. Ny fitsaboana tamin'ny 50 μM na 100 μM KAND 11 nandritra ny 1 ora dia nampihena be ny hakitroky ny kofehy actin ho 1.20 ± 0.62% na 0.61 ± 0.26%, tsirairay avy, raha toa kosa ny hakitroky ao amin'ny sela notsaboina DMSO dia 1.69 ± 0.51% (Sary 2). 7b). Ireo valiny ireo dia mifanohitra amin'ny vokatry ny propyzamide, izay tsy misy fiantraikany amin'ny kofehy actin, ary ny latrunculin B, depolymerizer actin izay tsy misy fiantraikany amin'ny microtubules (SI Sary S6). Ho fanampin'izany, ny fitsaboana amin'ny coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, na KAND 11 dia tsy nisy fiantraikany tamin'ny microtubules tao amin'ny sela HeLa (SI Sary S7). Noho izany, ny fomba fiasan'ny KAND 11 dia inoana fa tsy mitovy amin'ny an'ireo mpanakorontana ny sela ao amin'ny sela fantatra. Ankoatra izany, ny fandinihanay mikroskopika ny sela BY-2 notsaboina tamin'ny KAND 11 dia naneho ny fiandohan'ny fahafatesan'ny sela nandritra ny fitsaboana KAND 11 ary nampiseho fa ny isan'ny sela maty miloko manga Evans dia tsy nitombo be taorian'ny 30 minitra fitsaboana KAND 11, raha toa kosa ka taorian'ny 90 minitra fitsaboana tamin'ny 50 μM na 100 μM KAND, dia nitombo ho 43.7% na 80.1% ny isan'ny sela maty (Sary 7c). Raha fintinina, ireo angon-drakitra ireo dia manondro fa ny KAND 11 vaovao avy amin'ny asidra ursolic dia inhibitor cytoskeletal manokana ho an'ny zavamaniry miaraka amin'ny fomba fiasa tsy fantatra teo aloha.
Ny KAND dia misy fiantraikany amin'ny microtubules cortical, ny filaments actin, ary ny fahaveloman'ny sela BY-2 paraky. (a) Fahitana ny microtubules cortical ao amin'ny sela BY-2 eo anatrehan'ny TagRFP-TUA6. Ny sela BY-2 notsaboina tamin'ny KAND 11 (50 μM na 100 μM) na DMSO dia nodinihina tamin'ny alalan'ny mikroskopia confocal. Ny hakitroky ny microtubules cortical dia nokajiana avy amin'ny mikrografan'ny sela tsy miankina 25. Ny litera dia manondro fahasamihafana manan-danja (fitsapana Tukey HSD, p< 0.05). Bara mizana = 10 µm. (b) Ireo kofehy actin kortika ao amin'ny sela BY-2 nojerena teo anatrehan'ny GFP-ABD2. Ny sela BY-2 notsaboina tamin'ny KAND 11 (50 μM na 100 μM) na DMSO dia nojerena tamin'ny alalan'ny mikroskopia confocal. Ny hakitroky ny kofehy actin kortika dia nokajiana avy amin'ny mikrôgrafia misy sela tsy miankina 25. Ny litera dia manondro fahasamihafana manan-danja (fitsapana Tukey HSD, p< 0.05). Bara mizana = 10 µm. (c) Fandinihana ireo sela BY-2 maty tamin'ny alalan'ny fandokoana manga Evans. Ireo sela BY-2 notsaboina tamin'ny KAND 11 (50 μM na 100 μM) na DMSO dia nojerena tamin'ny alalan'ny mikroskopia mamiratra. n=3. Bara mizana = 100 µm.
Ny fahitana sy ny fampiharana ireo vokatra voajanahary vaovao dia nitarika fandrosoana lehibe teo amin'ny lafiny maro samihafa amin'ny fiainan'olombelona, anisan'izany ny fitsaboana sy ny fambolena. Nisy fikarohana ara-tantara natao mba hahazoana akora mahasoa avy amin'ny harena voajanahary. Indrindra indrindra, ny actinomycetes dia fantatra fa mahasoa ho antibiotika antiparasitika ho an'ny nematodes noho ny fahafahany mamokatra metabolites faharoa isan-karazany toy ny avermectin, ny akora mitarika ny ivermectin sy bleomycin ary ny vokatra azo avy aminy, izay ampiasaina amin'ny fitsaboana ho toy ny mpandraharaha miady amin'ny homamiadana21,22. Toy izany koa, karazana akora famonoana ahi-dratsy no hita avy amin'ny actinomycetes, ny sasany amin'izy ireo dia efa ampiasaina ara-barotra1,23. Noho izany, ny famakafakana ireo metabolites actinomycete mba hanavahana ireo vokatra voajanahary manana hetsika biolojika irina dia heverina ho paikady mahomby. Ato amin'ity fandalinana ity, dia nahita akora vaovao izahay, coumamonamide, avy amin'ny S. werraensis ary nahomby tamin'ny fanamboarana azy. Ny asidra Ursonic dia mpanelanelana sentetika amin'ny urbenamide sy ny vokatra azo avy aminy. Mety hiteraka fihovitrovitra mampiavaka ny fakany izany, mampiseho hetsika famonoana ahi-dratsy antonony ka hatramin'ny matanjaka, ary manimba mivantana na ankolaka ny microtubules amin'ny zavamaniry. Na izany aza, ny fomba fiasan'ny asidra urmotonic dia mety tsy hitovy amin'ny an'ny inhibitors microtubule efa misy, satria ny KAND 11 dia manakorontana ny kofehy actin ary miteraka fahafatesan'ny sela, izay manondro fomba fanaraha-maso izay ahafahan'ny asidra urmotonic sy ny vokatra azo avy aminy mitaona ny rafitra cytoskeletal isan-karazany.
Ny famaritana amin'ny antsipiriany bebe kokoa ny asidra urbenônika dia hanampy amin'ny fahatakarana tsara kokoa ny fomba fiasan'ny asidra urbenônika. Indrindra indrindra, ny tanjona manaraka dia ny fanombanana ny fahafahan'ny asidra ursonic mifamatotra amin'ny microtubules mihena mba hamaritana raha miasa mivantana amin'ny microtubules ny asidra ursonic sy ny vokatra azo avy aminy ary manala ny polymerization azy ireo, na raha miteraka fikorontanan'ny microtubules ny fiasan'izy ireo. Ho fanampin'izany, raha toa ka tsy lasibatra mivantana ny microtubules, ny famantarana ny toerana iasan'ny asidra ursonic sy ny lasibatra molekiola amin'ny sela zavamaniry dia hanampy amin'ny fahatakarana bebe kokoa ny toetran'ny singa mifandraika amin'izany sy ny fomba azo atao hanatsarana ny asan'ny herbicide. Ny fanadihadiana momba ny bioactivity anay dia naneho ny fahaiza-manao cytotoxic miavaka an'ny asidra ursonic amin'ny fitomboan'ny zavamaniry toy ny Arabidopsis thaliana, paraky ary liverwort, raha toa ka tsy voakasik'izany na ny sela E. coli na ny sela HeLa. Ny poizina kely na tsy misy amin'ny sela biby dia tombony amin'ny vokatra azo avy amin'ny asidra ursonic raha toa ka novolavolaina ho herbicide ampiasaina amin'ny saha fambolena misokatra izy ireo. Eny tokoa, satria rafitra mahazatra amin'ny eukaryotes ny microtubules, ny fanakanana azy ireo amin'ny zavamaniry dia fepetra takiana lehibe amin'ny herbicide. Ohatra, ny propyzamide, izay akora manala polymerization microtubule izay mifamatotra mivantana amin'ny tubuline ary manakana ny polymerization, dia ampiasaina ho herbicide noho ny tsy fahampian'ny poizina amin'ny selan'ny biby24. Mifanohitra amin'ny disopyramide, ny benzamides mifandraika amin'izany dia manana toetra manokana samihafa. Ankoatra ny microtubules amin'ny zavamaniry, ny RH-4032 na benzoxamide dia manakana ny microtubules amin'ny selan'ny biby na oomycetes ihany koa, ary ny zalilamide dia ampiasaina ho fungicide noho ny tsy fahampian'ny phytotoxicity25,26,27. Ny bera vao hita sy ny vokatra azo avy aminy dia mampiseho cytotoxicity voafantina amin'ny zavamaniry, saingy tsara ny manamarika fa ny fanovana fanampiny dia mety hanova ny toetra manokana kendreny, izay mety hanome vokatra fanampiny ho an'ny fanaraha-maso ny holatra pathogenic na oomycetes.
Ilaina amin'ny fampivoarana azy ireo ho toy ny herbicide sy ny fampiasana azy ho fitaovana fikarohana ny toetra mampiavaka ny asidra urbenônika sy ireo vokatra azo avy aminy. Eken'ny maro ny maha-zava-dehibe ny cytoskeleton amin'ny fanaraha-maso ny endriky ny sela zavamaniry. Ny fanadihadiana teo aloha dia naneho fa ny zavamaniry dia namorona mekanisma sarotra amin'ny fandaminana microtubule cortical amin'ny alàlan'ny fanaraha-maso ny dinamikan'ny microtubule mba hifehezana tsara ny morphogenesis. Maro ireo molekiola tompon'andraikitra amin'ny fanaraha-maso ny asan'ny microtubule no efa voafaritra, ary mbola mitohy ny fikarohana mifandraika amin'izany3,4,28. Ny fahatakarantsika ankehitriny momba ny dinamikan'ny microtubule ao amin'ny sela zavamaniry dia tsy manazava tanteraka ny mekanisma amin'ny fandaminana microtubule cortical. Ohatra, na dia samy afaka manala ny polymerization ny microtubule aza ny disopyramide sy ny oryzalin, ny disopyramide dia miteraka fikorontanan'ny fakany mafy raha toa kosa ny oryzalin dia manana fiantraikany malefaka. Ankoatra izany, ny fiovan'ny fototarazo ao amin'ny tubulin, izay manamafy orina ny microtubule, dia miteraka dextrorotation amin'ny fakany ihany koa, raha toa kosa ny paclitaxel, izay manamafy orina ny dinamikan'ny microtubule, dia tsy manao izany. Noho izany, ny fandalinana sy ny famantarana ny lasibatra molekiolan'ny asidra ursolic dia tokony hanome fahatakarana vaovao momba ny fanaraha-maso ny microtubule cortical amin'ny zavamaniry. Toy izany koa, ny fampitahana amin'ny ho avy ireo zavatra simika izay mahomby amin'ny fampiroboroboana ny fitomboana miolakolaka, toy ny disopyramide, sy ireo zavatra simika tsy dia mahomby loatra, toy ny oryzalin na asidra kumamotorika, dia hanome fanazavana momba ny fomba fitrangan'ny fitomboana miolakolaka.
Etsy ankilany, ny fandaminana indray ny sela ao amin'ny sela mifandraika amin'ny fiarovana dia mety ho fanazavana iray hafa ny cytotoxicity an'ny asidra ursonic. Ny aretina ateraky ny pathogen na ny fampidirana elicitor ao amin'ny sela zavamaniry dia indraindray miteraka fahasimban'ny cytoskeleton ary fahafatesan'ny sela manaraka izany29. Ohatra, ny cryptoxanthin avy amin'ny oomycete dia voalaza fa manakorontana ny microtubules sy ny filaments actin alohan'ny fahafatesan'ny sela paraky, mitovy amin'izay mitranga amin'ny fitsaboana KAND30,31. Ny fitoviana misy eo amin'ny valin'ny fiarovana sy ny valin'ny sela ateraky ny asidra ursonic dia nahatonga anay hihevitra fa miteraka dingana sela mahazatra izy ireo, na dia miharihary aza ny fiantraikan'ny asidra ursonic haingana kokoa sy matanjaka kokoa noho ny cryptoxanthin. Na izany aza, ny fanadihadiana dia naneho fa ny fikorontanan'ny filaments actin dia mampiroborobo ny fahafatesan'ny sela ho azy, izay tsy miaraka amin'ny fikorontanan'ny microtubule foana29. Ho fanampin'izany, mbola ho hita eo raha ny pathogen na ny elicitor no miteraka fitomboan'ny faka mikorontana, toy ny ataon'ny derivatives asidra ursonic. Noho izany, ny fahalalana molekiola mampifandray ny valin'ny fiarovana sy ny cytoskeleton dia olana manintona hovahana. Amin'ny alàlan'ny fanararaotana ny fisian'ny singa misy lanja molekiola ambany mifandraika amin'ny asidra ursonic, ary koa ireo karazana akora avy amin'izany miaraka amin'ny hery samihafa, dia mety hanome fahafahana hikendry mekanisma sela tsy fantatra izy ireo.
Raha fintinina, ny fahitana sy ny fampiharana ireo singa vaovao izay manova ny dinamikan'ny mikrôtubula dia hanome fomba mahery vaika handaminana ireo mekanisma molekiolaly sarotra izay fototry ny famaritana ny endriky ny sela zavamaniry. Amin'izany toe-javatra izany, ny singa asidra urmotonic vao noforonina, izay misy fiantraikany amin'ny mikrôtubula sy ny kofehy actin ary miteraka fahafatesan'ny sela, dia mety hanome fahafahana hamakafaka ny fifandraisana misy eo amin'ny fanaraha-maso ny mikrôtubula sy ireo mekanisma hafa ireo. Noho izany, ny fanadihadiana simika sy biolojika mampiasa asidra urbenonic dia hanampy antsika hahatakatra ireo mekanisma mifehy ny molekiolaly izay mifehy ny cytoskeleton-n'ny zavamaniry.
Ampidiro ao anaty tavoara Erlenmeyer 500 mL misy fangaro voa 110 mL misy galactose 2% (w/v), paty Essence 2% (w/v), Bacto 1% (w/v), nalaina avy amin'ny katsaka 0.5% (w/v) (KOGOSTCH Co., Ltd., Japon), (NH4)2SO4 0.2% (w/v) ary CaCO3 0.2% ao anaty rano deionized (pH 7.4 alohan'ny hanaovana sterilization). Notehirizina tamin'ny "rotary shaker" (180 rpm) tamin'ny 27°C nandritra ny 2 andro ny kolontsaina voa. Ny fambolena dia natao tamin'ny alalan'ny fermentation solid state. Nafindra tao anaty tavoara K-1 500 ml misy akora famokarana 40 g misy vary orza voaporitra 15 g (MUSO Co., Ltd., Japon) sy rano deionized 25 g (tsy namboarina ny pH talohan'ny fanadiovana). Natao tao anaty haizina nandritra ny 14 andro tamin'ny 30°C ny fermentation. Nalaina tamin'ny EtOH 40 ml/tavoahangy ny akora fermentation ary nosantrifizina (1500 g, 4°C, 10 minitra). Nalaina tamin'ny fangaro 10% MeOH/EtOAc ny ranoka avy amin'ny culture supernatant (60 ml). Nesorina tamin'ny tsindry nihena ny sosona organika mba hahazoana sisa tavela (59.5 mg), izay nampiharina tamin'ny HPLC niaraka tamin'ny gradient elution (0–10 minitra: 90%) teo amin'ny tsanganana dingana mivadika (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × halavany 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minitra: 90% H2O/CH3CN hatramin'ny 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minitra: 90% H2O/EtOH, 45–155 minitra: 90% H2O/EtOH hatramin'ny 100% EtOH (gradient (gradient), 155–200 minitra: 100% EtOH) amin'ny tahan'ny fikorianan'ny 1.5 ml/min, coumamonamide (1, 36.0 mg) dia navahana ho vovoka fotsy tsy misy endrika.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ sanda voakajy: 141.0659, sanda voarefy: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Avy amin'ny Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) no nahazoana alalana hampiasaina amin'ny fikarohana ny voan'ny Columbia (Col-0). Nampiasaina sy notehirizina araka ny fepetra ao amin'ny laboratoara ny voan'ny Col-0 ary nampiasaina ho zavamaniry Arabidopsis karazana dia. Nodiovina tamin'ny tany ny voan'ny Arabidopsis ary novolena tao anaty ranoka Murashige sy Skoog antsasany misy siramamy 2% (Fujifilm Wako Pure Chemical), asidra 2-(4-morpholino)ethanesulfonic (MES) 0.05% (w/v) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ary agar 1.5% (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, amin'ny 23 °C sy amin'ny hazavana tsy tapaka. Ny voan'ny phs1-1 mutant dia nomen'i T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Ny T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) no nanome ny voan'ny karazana SR-1 ary nampiasaina ho zavamaniry paraky karazana dia. Nodiovina ny ety ambonin'ny tany ny voan'ny paraky ary nalona tao anaty rano madio nandritra ny telo alina mba hampiroboroboana ny fitsimohany, avy eo napetraka tao anaty vahaolana antsasaky ny hery misy siramamy 2%, MES 0.05% (w/v), ary gellan gum 0.8% (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. sy Skoog medium) miaraka amin'ny pH 5.7 ary notehirizina tamin'ny 23°C teo ambanin'ny hazavana tsy tapaka.
Ny T. Kohchi (Oniversite Kyoto) no nanome ny karazana Tak-1 ary nampiasaina ho fitaovana fanandramana mahazatra ho an'ny fandalinana ny voan'ny aty. Ny Gemma dia nalaina avy amin'ny zavamaniry novolena efa nodiovina ary avy eo dia napetraka tamin'ny fitaovana Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) misy siramamy 1% sy ditin-kazo gellan 0.3% ary notehirizina tamin'ny 23°C teo ambanin'ny hazavana mitohy.
Ny sela BY-2 paraky (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) dia nomen'i S. Hasezawa (Oniversite an'i Tokyo). Ny sela BY-2 dia natsonika in-95 tao anaty medium Linsmeier sy Skoog novaina ary nampiana asidra 2,4-dichlorophenoxyacetic 32 isan-kerinandro. Ny fampiatoana sela dia nafangaro tamin'ny rotary shaker tamin'ny 130 rpm tamin'ny 27°C tao anaty haizina. Sasao amin'ny medium vaovao in-10 ny habetsahan'ny sela ary avereno mihantona ao anaty medium mitovy. Ny tsipika sela transgenic BY-2 izay maneho tsara ny marika microtubule TagRFP-TUA6 na ny marika filament actin GFP-ABD2 eo ambanin'ny promoter cauliflower mosaic virus 35S dia novokarina araka ny voalaza 33,34,35. Ireo tsipika sela ireo dia azo tazonina sy ampifanarahana amin'ny alàlan'ny fomba fiasa mitovy amin'ireo ampiasaina amin'ny tsipika sela BY-2 tany am-boalohany.
Novolena tao anaty Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) izay nasiana sérum bovine 10%, penicillin 1.2 U/ml, ary streptomycin 1.2 μg/ml tao anaty incubator 37°C misy CO2 5% ny sela HeLa.
Ny andrana rehetra voalaza ato amin'ity sora-tanana ity dia natao mifanaraka amin'ny fitsipika sy torolàlana momba ny fiarovana biolojika Japoney.
Natsonika tao anaty dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ho vahaolana fototra ireo akora ary natsonika tao anaty fitaovana MS ho an'ny Arabidopsis sy fitaovana paraky na Gamborg B5 ho an'ny liverwort. Ho an'ny fanadihadiana momba ny fanakanana ny fitomboan'ny faka, dia nafafy tamin'ny fitaovana agar misy ireo akora voalaza na DMSO ny voa mihoatra ny 10. Notehirizina tao anaty efitrano fitomboana nandritra ny 7 andro ny voa. Nalaina sary ireo zana-kazo ary norefesina ny halavan'ny faka. Ho an'ny fanadihadiana momba ny fitsimohan'ny Arabidopsis, dia nafafy tamin'ny fitaovana agar misy akora 200 μM na DMSO ny voa 48 isaky ny takelaka. Nambolena tao anaty efitrano fitomboana ny voa Arabidopsis ary nisaina 7 andro taorian'ny fitsimohany (dag) ny isan'ny zana-kazo nitsimoka. Ho an'ny fanadihadiana momba ny fitsimohan'ny paraky, dia nafafy tamin'ny fitaovana agar misy KAND na DMSO 200 μM ny voa 24 isaky ny takelaka. Nambolena tao anaty efitrano fitomboana ny voan'ny paraky ary nisaina taorian'ny 14 andro ny isan'ny zana-kazo nitsimoka. Ho an'ny fanadihadiana momba ny fanakanana ny fitomboan'ny voan'ny aty, dia napetraka teo ambonin'ny agar-agar misy ny fifantohana KAND na DMSO voalaza ny embryon 9 avy amin'ny takelaka tsirairay ary notehirizina tao anaty efitrano fitomboana nandritra ny 14 andro.
Ampiasao ireo zana-kazo nolokoina propidium iodide (PI) 5 mg/ml mba hijerena ny firafitry ny meristem-paka. Nojerena tamin'ny alalan'ny mikroskopia fluorescence ny famantarana PI, izay nampiasa mikroskopia TCS SPE confocal laser scanning (Leica Microsystems).
Ny fandokoana histochemical ny fakany tamin'ny β-glucuronidase (GUS) dia natao araka ny protocole nohazavain'i Malami sy Benfey36. Napetraka tao anaty acétone 90% nandritra ny alina ny zana-kazo, nolokoina tamin'ny asidra 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic 0.5 mg/ml tao anaty buffer GUS nandritra ny adiny 1 ary napetraka tao anaty vahaolana chloraldehyde hydrated. (chloral hydrate 8 g, rano 2 ml ary glycerol 1 ml) ary nojerena tamin'ny alalan'ny mikroskopia interference differential contrast mampiasa mikroskopia Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Norefesina tamin'ireo zana-kazo 7 andro nambolena teo amin'ny takelaka napetraka mitsangana ny zoro fakany. Refeso ny zoro misy ny fakany manomboka amin'ny lalana mankany amin'ny vecteur gravité araka ny voalaza ao amin'ny dingana 6.
Hita araka ny voalaza ny fandaminana ny mikrôtubula kortika, miaraka amin'ny fanovana kely amin'ny protocole 37. Ny antibody anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) sy ny Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) dia nampiasaina ho antibody voalohany sy faharoa amin'ny dilutions 1:1000 sy 1:100. Ny sary fluorescence dia nalaina tamin'ny alàlan'ny mikroskopia TCS SPE confocal laser scanning (Leica Microsystems). Makà sary Z-stack ary mamoròna projection hamafin'ny ambony indrindra araka ny torolalan'ny mpanamboatra.
Natao tamin'ny alalan'ny Cell Counting Kit 8 (Dojindo) ny fanadihadiana momba ny fihanaky ny sela HeLa araka ny torolalan'ny mpanamboatra.
Nodinihina tamin'ny alalan'ny fandrefesana ny hakitroky ny sela tao anaty kolontsaina tamin'ny alalan'ny spektrofotometatra amin'ny 600 nm (OD600) ny fitomboan'ny E. coli DH5α.
Nojerena ny fandaminana ny taolana ao amin'ny sela BY-2 transgenic tamin'ny alalan'ny mikroskopia fluorescence misy fitaovana fitiliana confocal CSU-X1 (Yokogawa) sy fakantsary sCMOS (Zyla, Andor Technology). Nojerena tamin'ny alalan'ny famakafakana sary ny hakitroky ny taolana, izay nandrefesana ny isan-jaton'ny piksela cytoskeletal eo amin'ireo piksela cytoskeletal ao amin'ny sary confocal tamin'ny alalan'ny rindrambaiko ImageJ araka ny voalaza38,39.
Mba hamantarana ny fahafatesan'ny sela ao amin'ny sela BY-2, dia notehirizina tamin'ny Evans manga 0.05% nandritra ny 10 minitra tamin'ny mari-pana ao an-trano ny ampahany amin'ny fampiatoana sela. Ny fandokoana sela maty amin'ny manga Evans voafantina dia miankina amin'ny fivoahan'ny loko avy amin'ny sela velona amin'ny alalan'ny fonon'ny plasma tsy simba40. Nojerena tamin'ny alalan'ny mikroskopia mamiratra (BX53, Olympus) ireo sela voaloko.
Nobeazina tao amin'ny DMEM ny sela HeLa izay nampiana FBS 10% tao anaty incubator mando amin'ny 37°C sy CO2 5%. Notsaboina tamin'ny 100 μM KAND 11, asidra kumamonamika 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), na 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) nandritra ny 6 ora tamin'ny 37°C ny sela. Nohamafisina tamin'ny MetOH nandritra ny 10 minitra ny sela ary avy eo tamin'ny acetate nandritra ny 5 minitra tamin'ny mari-pana ao an-trano. Notehirizina tamin'ny antibody voalohany β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) nolevonina tamin'ny 0.5% BSA/PBS nandritra ny 2 ora ny sela raikitra, nosasana in-3 tamin'ny TBST, ary avy eo notehirizina tamin'ny antibody osy Alexa Fluor. 488 1 ora. – IgG totozy (Thermo Fisher Scientific: A11001) sy 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) natsonika tao anaty BSA/PBS 0.5%. Rehefa avy nosasana tamin'ny TBST intelo, dia nojerena tamin'ny mikraoskaopy Nikon Eclipse Ti-E mivadika ireo sela voaloko. Nalaina tamin'ny fakantsary Hamamatsu ORCA-R2 CCD mangatsiaka mampiasa rindrambaiko MetaMorph (Molecular Devices) ireo sary.
Fotoana fandefasana: 17 Jona 2024