Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Ny kinova navigateur ampiasainao dia manana fanohanana CSS voafetra.Mba hahazoana vokatra tsara indrindra, dia manoro hevitra izahay ny hampiasa dikan-teny vaovao amin'ny navigateur anao (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Mandritra izany fotoana izany, mba hiantohana ny fanohanana mitohy, dia asehoy ny tranokala tsy misy styling na JavaScript.
Ny fahitana sy ny fampiasana mahasoa ny vokatra voajanahary dia afaka manampy amin'ny fanatsarana ny fiainan'ny olombelona.Ny akora simika manakana ny fitomboan'ny zavamaniry dia ampiasaina betsaka amin'ny herbicide hifehezana ny ahi-dratsy.Noho ny filàna ny fampiasana karazana herbicides isan-karazany dia ilaina ny mamantatra ireo fitambarana misy fomba fiasa vaovao.Tao anatin'ity fandalinana ity dia nahita fitambarana N -alkoxypyrrole vaovao izahay, coumamonamide, avy amin'ny Streptomyces werraensis MK493-CF1 ary nametraka ny fizotran'ny synthesis feno.Tamin'ny alalan'ny fitiliana asa biolojika dia hitanay fa ny asidra urs-monoamic dia mpanelanelana sintetika amin'ny urs-monoamide ary mety hofanesoran'ny fitomboan'ny zavamaniry.Ankoatra izany, dia namolavola karazana asidra urbenônika isan-karazany izahay, anisan'izany ny derivative urbenyloxy (UDA), izay manana herbicidal avo lenta nefa tsy misy fiantraikany ratsy amin'ny fitomboan'ny sela HeLa.Hitanay ihany koa fa ny derivatives amin'ny asidra urmotonika dia manelingelina ny microtubule amin'ny zavamaniry;Ankoatr'izay, ny KAND dia misy fiantraikany amin'ny filamenta aktin ary miteraka fahafatesan'ny sela;Ireo vokatra marobe ireo dia tsy mitovy amin'ny an'ny microtubule inhibitors fantatra ary manolotra fomba fiasa vaovao ho an'ny asidra ursonic, izay maneho tombony lehibe amin'ny famolavolana herbicides vaovao.
Ny fahitana sy ny fampiharana ny vokatra voajanahary mahasoa sy ny vokatra azo avy aminy dia fomba iray hanatsarana ny kalitaon'ny fiainan'ny olombelona.Ny metabolites faharoa novokarin'ny zavamiaina bitika, zavamaniry ary bibikely dia nitarika fandrosoana lehibe teo amin'ny fitsaboana sy ny fambolena.Betsaka ny antibiotika sy fanafody miady amin'ny leukemia novolavolaina avy amin'ny vokatra voajanahary.Ankoatra izany, karazana isan-karazanyfanafody famonoana bibikely, fungicides sy herbicides dia alaina avy amin'ireo vokatra voajanahary ampiasaina amin'ny fambolena.Indrindra indrindra, ny herbicides miady amin'ny ahi-dratsy dia fitaovana manan-danja amin'ny fampitomboana ny vokatra amin'ny fambolena maoderina, ary efa ampiasaina amin'ny varotra ny karazan-javatra isan-karazany.Ny dingana maro amin'ny sela ao amin'ny zavamaniry, toy ny photosynthesis, metabolism asidra amine, synthesis ny rindrin'ny sela, ny fifehezana ny mitosis, ny famantarana ny phytohormone, na ny synthesis proteinina, dia heverina ho lasibatra mahazatra amin'ny herbicides.Ny fitambarana manakana ny fiasan'ny microtubule dia karazana herbicide mahazatra izay misy fiantraikany amin'ny fitomboan'ny zavamaniry amin'ny alàlan'ny fiatraikany amin'ny regulation mitotic2.
Ny microtubule dia singa ao amin'ny cytoskeleton ary voatahiry betsaka ao amin'ny sela eukaryotic.Ny heterodimer tubulin dia misy α-tubulin sy β-tubulin izay mamorona protofilaments microtubule linear, miaraka amin'ny protofilaments 13 mamorona rafitra cylindrical.Ny microtubules dia mitana anjara toerana maro ao amin'ny selan'ny zavamaniry, ao anatin'izany ny famaritana ny endriky ny sela, ny fizarazarana sela ary ny fitaterana intracellular3,4.Ny selan'ny zavamaniry dia misy microtubules ao ambanin'ny membrane plasma interphase, ary ireo antsoina hoe microtubules cortical ireo dia heverina ho mifehy ny fandaminana ny microfibrils cellulose amin'ny alàlan'ny fifehezana ny cellulose synthase complexes4,5.Ny microtubules cortical amin'ny selan'ny epidermal fakany, izay hita ao amin'ny faritry ny fanitarana haingana ny tendron'ny fakany, dia hita any aoriana, ary ny microfibers cellulose dia manaraka ireo microtubules ireo ary mametra ny lalan'ny fanitarana ny sela, ka mampiroborobo ny fanitarana sela anisotropic.Noho izany, ny fiasan'ny microtubule dia mifandray akaiky amin'ny morphologie zava-maniry.Ny fanoloana asidra amino amin'ny fototarazo mandika ny tubulin dia miteraka fikorontanan'ny microtubule cortical sy ny fitomboan'ny ilany havia na havanana amin'ny Arabidopsis 6,7.Toy izany koa, ny fiovan'ny proteinina mifandray amin'ny microtubule izay mandrindra ny dinamika microtubule dia mety hitarika amin'ny fitomboan'ny faka8,9,10,11,12,13.Ankoatr'izay, ny fitsaboana amin'ny herbicide manimba microtubule toy ny disopyramide, fantatra amin'ny anarana hoe pretilachlor, dia miteraka fitomboan'ny faka miolikolika amin'ny ilany havia14.Ireo angon-drakitra ireo dia manondro fa ny fanaraha-maso marina ny fiasan'ny microtubule dia tena ilaina amin'ny famaritana ny lalan'ny fitomboan'ny zavamaniry.
Misy karazana microtubule inhibitors hita, ary ireo fanafody ireo dia nandray anjara lehibe tamin'ny fikarohana cytoskeletal, ary koa tamin'ny fambolena sy ny fitsaboana2.Indrindra indrindra, ny oryzalin, ny dinitroaniline, ny disopyramide, ny fitambarana mifandraika amin'ny benzamide, ary ny analogues dia afaka manakana ny fiasan'ny microtubule ary noho izany dia manakana ny fitomboan'ny zavamaniry.Noho izany dia ampiasaina betsaka amin'ny herbicides izy ireo.Na izany aza, satria ny microtubule dia singa manan-danja amin'ny selan'ny zavamaniry sy ny biby, ny ankamaroan'ny microtubule inhibitors dia cytotoxic amin'ny karazana sela roa.Noho izany, na dia eo aza ny fampiasa azy ireo ho herbicides, dia voafetra ny isan'ny antimicrotubule agents ampiasaina amin'ny tanjona azo ampiharina.
Streptomyces dia karazana avy amin'ny fianakaviana Streptomyces, izay ahitana bakteria aerôbika, gram-positive, filamentous ary malaza amin'ny fahaizany mamokatra metabolita faharoa marobe.Noho izany dia heverina ho iray amin'ireo loharano manan-danja indrindra amin'ny vokatra voajanahary biolojika mavitrika.Tao anatin'ny fanadihadiana amin'izao fotoana izao dia nahita fitambarana vaovao antsoina hoe coumamonamide izahay, izay natokana tamin'ny Streptomyces werraensis MK493-CF1 sy S. werraensis ISP 5486. Amin'ny fampiasana ny famakafakana spectral sy ny famakafakana spectral feno, ny firafitry ny coumamonamide dia voamarika ary ny taolam-paty N-alkoxypyrrole tokana. dia tapa-kevitra.synthesis.Ny asidra ursmonic, mpanelanelana sentetika amin'ny ursmonoamide sy ny vokatra azo avy aminy, dia hita fa manakana ny fitomboana sy ny fitsimohany ny zavamaniry malaza Arabidopsis thaliana.Tamin'ny fanadihadiana momba ny fifandraisana amin'ny firafitry ny asa, dia hitanay fa ny fitambarana misy C9 novaina ho asidra ursonic, antsoina hoe nonyloxy derivative of ursonic acid (KAND), dia mampitombo be ny fiantraikany amin'ny fitomboana sy ny fitsimohany.Marihina fa nisy fiantraikany teo amin'ny fitomboan'ny paraky sy ny atiny ihany koa ilay inhibitory fitomboan'ny zavamaniry vao hita ary tsy cytotoxic amin'ny bakteria na sela HeLa.Ankoatr'izay, ny derivatives amin'ny asidra urmotonika sasany dia miteraka phenotype fotony mivadika, izay midika fa ireo derivatives ireo dia misy fiantraikany mivantana na ankolaka amin'ny microtubule.Mifanaraka amin'io hevitra io, ny fandinihanay momba ny microtubules misy marika na immunohistochemically na miaraka amin'ny proteinina fluorescent dia manondro fa ny fitsaboana KAND dia manala ny microtubule.Ankoatr'izay, ny fitsaboana amin'ny derivatives amin'ny asidra kumamotonika dia nanakorontana ny microfilaments actin.Noho izany, nahita inhibitor fitomboan'ny zavamaniry vaovao isika izay misy fomba fiasa miavaka amin'ny famotehana ny cytoskeleton.
Ny strain MK493-CF1 dia natokana tamin'ny tany tao Shinagawa-ku, Tokyo.Ny tadin'ny MK493-CF1 dia namorona mycelium stroma tsara sampana.Ny fizotry ny ampahany amin'ny 16S ribosom RNA (1422 bp) dia voafaritra.Ity karazana ity dia mitovy amin'ny S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tebiteby mahazatra, 99,93%).Araka io vokatra io, dia fantatra fa mifandray akaiky amin'ny karazana karazana S. werraensis io karazany io.Noho izany, nomenay vonjimaika ity karazana S. werraensis MK493-CF1 ity.S. werraensis ISP 5486T ihany koa dia mamokatra fitambarana bioactive mitovy.Koa satria tsy dia nisy fikarohana tany am-boalohany momba ny fahazoana vokatra voajanahary avy amin'ity microorganism ity, dia nisy fikarohana simika fanampiny natao.Taorian'ny fambolena ny S. werraensis MK493-CF1 amin'ny fako amin'ny vary orza amin'ny fermentation solid-state amin'ny 30 ° C mandritra ny 14 andro, dia nalaina tamin'ny 50% EtOH ny fitaovana.60 ml ny santionany dia maina mba hahazoana 59,5 mg of crude extract.Ny fitrandrahana crude dia niharan'ny HPLC dingana mivadika mba hanomezana N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, antsoina hoe coumamonamide, 36.0 mg).Ny totalin'ny 1 dia eo amin'ny 60% amin'ny fitrandrahana manta.Noho izany dia nanapa-kevitra ny handalina amin'ny antsipiriany ny fananana kumamotoamide 1 izahay.
Coumamonamide 1 dia vovoka amorphous fotsy ary ny spectrometry faobe avo lenta (HRESIMS) dia manamafy ny C6H8N2O2 (sary 1).Ny sombintsombiny pyrrole voasolo C2 amin'ity fitambarana ity dia miavaka amin'ny δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH amin'ny 1H NMR spectrum: 4.5 Hz , H-5) ary δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), ary ny spectrum 13C NMR dia mampiseho ny fisian'ny atoma karbona sp2 efatra.Ny fisian'ny vondrona amide amin'ny toeran'ny C2 dia nodinihina tamin'ny fifandraisan'ny HMBC avy amin'ny proton C-3 mankany amin'ny carbonyl carbonyl amin'ny δC 161.1.Ankoatr'izay, ny 1 H sy 13 C NMR dia miakatra amin'ny δH 4.10 (3H, S) ary ny δC 68.3 dia manondro ny fisian'ny vondrona N-methoxy ao amin'ny molekiola.Na dia mbola tsy voafaritra tsara aza ny toerana misy ny vondrona methoxy amin'ny fampiasana famakafakana spektroskopika toy ny spectroscopy amin'ny fahasamihafana kokoa sy ny fanafohezana ny nokleary Overhauser (NOEDF), ny N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide dia lasa fitambarana kandidà voalohany.
Mba hamaritana ny rafitra marina amin'ny 1, dia natao ny synthesis manontolo (sary 2a).Ny fitsaboana ny 2-aminopyridine 2 azo amidy amin'ny m-CPBA dia nahatonga ny N-oxide 3 mifanaraka amin'ny vokatra azo.Taorian'ny 2-aminoazidation of 2, ny fanehoan-kevitry ny cyclocondensation nofaritan'i Abramovich dia natao tamin'ny benzene amin'ny 90 ° C mba hahazoana ny 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 amin'ny grama.Hafainganam-pandeha 60% (dingana roa).15,16.Ny methylation sy ny hydrolysis ny 4 dia nanome asidra 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic (antsoina hoe "asidra cumotonic", 6) amin'ny vokatra tsara (70%, dingana roa).Farany, ny amidation amin'ny alalan'ny asidra klôro intermediate 6 mampiasa amoniaka rano dia nanome Kumamoto amide 1 amin'ny 98% vokatra.Ny angon-drakitra rehetra momba ny 1 synthesized dia mitovy amin'ny 1 mitokana, noho izany dia voafaritra ny firafitry ny 1;
General synthesis sy famakafakana ny asa biolojika ny urbenamide sy urbenic asidra.(a) Ny fitambaran'ny amide Kumamoto.(b) Ny zana-kazo Arabidopsis Columbia (Col) karazana bibidia fito andro dia nambolena tamin'ny takelaka Murashige sy Skoog (MS) misy coumamonamide 6 na coumamonamide 1 amin'ny fifantohana voalaza.Haavony = 1 sm.
Voalohany, nanombantombana ny hetsika biolojikan'ny urbenamide sy ny mpanelanelana ao aminy noho ny fahaizany manova ny fitomboan'ny zavamaniry.Nampiana fifantohana isan-karazany ny ursmonamide 1 na ny asidra ursmonic 6 amin'ny medium MS agar sy ny zana-kazo Arabidopsis thaliana kolontsaina amin'ity fitaovana ity.Ireo fitsapana ireo dia nampiseho fa ny fifantohana avo (500 μM) amin'ny 6 dia nanakana ny fitomboan'ny faka (sary 2b).Avy eo, namorona derivatives isan-karazany izahay tamin'ny fanoloana ny toeran'ny N1 an'ny 6 ary nanao fanadihadiana momba ny fifandraisana ara-drafitra-asa momba azy ireo (ny fizotran'ny synthesis analogue dia voafaritra ao amin'ny Information Supporting (SI)).Ny zana-kazo Arabidopsis dia nambolena tamin'ny fitaovana misy asidra ursonic 50 μM, ary norefesina ny halavan'ny fakany.araka ny hita eo amin’ny sary.Araka ny asehon'ny sary 3a, b, ary S1, ny asidra coumamo dia manana halavan'ny rojo alkoxy linear (9, 10, 11, 12, ary 13) na rojo alkoxy lehibe (15, 16, ary 17) amin'ny toerana N1.Nasehon'ireo derivatives ny fanakanana lehibe ny fitomboan'ny fakany.Ankoatra izany, hitanay fa ny fampiharana ny 200 μM 10, 11, na 17 dia nanakana ny fitsimohany (sary 3c sy S2).
Fandalinana ny fifandraisana ara-drafitra amin'ny amide Kumamoto sy ireo singa mifandraika amin'izany.(a) Ny rafitra sy ny rafitra synthesis ny analogues.(b) Famaritana ny halavan'ny fakan'ny zana-kazo 7 andro nambolena tamin'ny medium MS miaraka amin'ny derivatives coumamonamide 50 μM na tsy misy.Ny asterisk dia manondro fahasamihafana lehibe amin'ny fitsaboana saro-pantarina (t test, p<0.05).n>18. Ny angon-drakitra dia aseho ho mean ± SD.nt dia midika hoe "tsy voazaha toetra" satria mihoatra ny 50% ny voa tsy nitsimoka.(c) Famaritana ny tahan'ny fitsimohany ny masomboly voakarakara mandritra ny 7 andro ao amin'ny medium MS miaraka amin'ny coumamonamide 200 μM na tsy misy ifandraisany.Ny asterisk dia manondro fahasamihafana lehibe amin'ny fitsaboana saro-pady (fitsapana chi-square).n=96.
Mahaliana fa ny fanampin'ny rojo vy alkyl lava kokoa noho ny C9 dia nampihena ny hetsika fanakantsakanana, ka nanoro hevitra fa ny fitambaran'ny asidra kumamotoika dia mitaky rojo vy amin'ny habe iray hanehoana ny asany biolojika.
Satria ny fanadihadiana momba ny fifandraisana amin'ny firafitry ny asa dia naneho fa ny C9 dia novaina ho asidra ursonic ary ny derivative nonyloxy amin'ny asidra ursonic (antsoina hoe KAND 11) no fitaovana mahomby indrindra amin'ny fitomboan'ny zavamaniry, dia nanao famaritana bebe kokoa momba ny KAND 11 izahay. Fitsaboana ny Arabidopsis miaraka amin'ny 50 μM KAND 11 saika nisakana tanteraka ny fitsimohany, fa ny fifantohana ambany kokoa (40, 30, 20, na 10 μM) amin'ny KAND 11 dia nanakana ny fitomboan'ny faka amin'ny fomba miankina amin'ny doka (sary 4a, b).Mba hitsapana raha misy fiantraikany amin'ny fahavitan'ny meristem fakany ny KAND 11, dia nandinika ny meristem fakan-kazo voaloto tamin'ny propidium iodide (PI) izahay ary nandrefy ny haben'ny faritra meristem.Ny haben'ny meristem ny zana-kazo nambolena tamin'ny fitaovana misy 25 μM KAND-11 dia 151.1 ± 32.5 μm, raha ny haben'ny meristem ny zana-kazo nambolena tamin'ny fitaovana fanaraha-maso misy DMSO dia 264.7 ± 30.8 μm (sary 4c, d). , izay manondro fa ny KAND-11 dia mamerina ny asan'ny sela.miparitaka.Root meristem.Mifanaraka amin'izany, ny fitsaboana KAND 11 dia nampihena ny habetsahan'ny marika fizarazarana sela CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS famantarana ao amin'ny meristem fakany (sary 4e) 17.Ireo vokatra ireo dia manondro fa ny KAND 11 dia manakana ny fitomboan'ny faka amin'ny alàlan'ny fampihenana ny hetsika fihanaky ny sela.
Famakafakana ny fiantraikan'ny derivatives amin'ny asidra urbenonika (derivatives urbenyloxy) amin'ny fitomboana.(a) zana-kazo Col karazana 7 andro nambolena teo amin'ny takelaka MS miaraka amin'ny fatran'ny KAND 11 voalaza.b) Famaritana ny halavan'ny faka.Ny litera dia manondro fahasamihafana lehibe (fitsapana Tukey HSD, p<0.05).n>16. Ny angon-drakitra dia aseho ho mean ± SD.(c) Microscopie confocal amin'ny fakan'ny karazana Col propidium iodide voaloto amin'ny takelaka MS misy na tsy misy 25 μM KAND 11. Ny fononteny fotsy dia manondro meristem fakany.Scale bar = 100 µm.(d) Famaritana ny haben'ny meristem fakany (n = 10 hatramin'ny 11).Ny fahasamihafan'ny statistika dia nofaritana tamin'ny t-test (p<0.05).Ny bara dia maneho ny haben'ny meristem antonony.(e) Mikroskopian'ny fifanoherana amin'ny fifanoherana samihafa (DIC) amin'ny meristem-paka misy ny fananganana CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS voaloko sy voaloto amin'ny zana-kazo 5 andro nambolena tamin'ny takelaka MS misy na tsy misy 25 µM KAND assay.
Ny phytotoxicity an'ny KAND 11 dia notsapaina bebe kokoa tamin'ny fampiasana zava-maniry dicotyledonous hafa, paraky (Nicotiana tabacum), ary zavamananaina modely lehibe amin'ny tany, liverwort (Marchantia polymorpha).Toy ny tamin'ny Arabidopsis, ny zana-ketsa SR-1 paraky izay nambolena tamin'ny antonony misy 25 μM KAND 11 dia niteraka faka fohy kokoa (sary 5a).Fanampin'izany, ny voa 40 amin'ny 48 dia nitsimoka tamin'ny takelaka misy 200 μM KAND 11, fa ny voa 48 rehetra kosa dia nitsimoka tamin'ny haino aman-jery naneso, izay manondro fa ny habetsahan'ny KAND dia manan-danja (p).< 0,05;chi test -square) nanakana ny fitsimohany ny paraky.(sary 5b).Ankoatra izany, ny fifantohana amin'ny KAND 11 izay manakana ny fitomboan'ny bakteria amin'ny atiny dia mitovy amin'ny fifantohana mahomby amin'ny Arabidopsis (sary 5c).Ireo vokatra ireo dia manondro fa ny KAND 11 dia afaka manakana ny fitomboan'ny zavamaniry isan-karazany.Avy eo izahay dia nanadihady ny mety ho cytotoxicity ny orsa monoamide mifandray amin'ny zavamananaina hafa, dia ny olombelona HeLa sela sy Escherichia coli strain DH5α, ho toy ny solontenan'ny biby ambony kokoa sy ny bakteria sela, tsirairay avy.Tao anatin'ny andian-dahatsoratra momba ny fitomboan'ny sela, dia nahatsikaritra izahay fa ny coumamonamide 1, ny asidra coumamonamidic 6, ary ny KAND 11 dia tsy misy fiantraikany amin'ny fitomboan'ny sela HeLa na E. coli amin'ny fifantohana amin'ny 100 μM (sary 5d, e).
Ny fanakanana ny fitomboan'ny KAND 11 amin'ny zavamananaina tsy Arabidopsis.(a) Ny zana-ketsa SR-1 karazana bibidia roa herinandro dia nambolena tamin'ny takelaka MS mitsangana mitsangana misy 25 μM KAND 11. (b) zana-ketsa SR-1 karazany roa herinandro dia nambolena tamin'ny toerana mitsivalana. Ny takelaka MS misy 200 μM KAND 11. (c) Ny tsimok'aretin'ny atiny Tak-1 karazana roa herinandro nambolena tamin'ny takelaka Gamborg B5 miaraka amin'ny fifantohana KAND 11 voatondro. fe-potoana.(d) Fanamarinana ny fihanaky ny sela amin'ny sela HeLa.Ny isan'ny sela velona dia norefesina tamin'ny elanelana raikitra tamin'ny fampiasana kitapo fanisana sela 8 (Dojindo).Ho fanaraha-maso, ny sela HeLa dia notsaboina tamin'ny 5 μg / ml actinomycin D (Act D), izay manakana ny transcription polymerase RNA ary mahatonga ny fahafatesan'ny sela.Ny famakafakana dia natao tamin'ny triplicate.(e) fitiliana ny fihanaky ny sela E. coli.Ny fitomboan'ny E. coli dia nodinihina tamin'ny fandrefesana OD600.Ho fanaraha-maso, ny sela dia notsaboina tamin'ny 50 μg / ml ampicillin (Amp), izay manakana ny fananganana rindrin'ny bakteria.Ny famakafakana dia natao tamin'ny triplicate.
Mba hamaritana ny fomba fiasan'ny cytotoxicity ateraky ny kanto mifandray amin'ny uramide, dia nodinihinay indray ny derivatives amin'ny asidra urbenika miaraka amin'ny fiatoana antonony.araka ny hita eo amin’ny sary.Araka ny aseho amin'ny sary 2b, 6a, ny zana-kazo maniry amin'ny takelaka agar izay misy asidra urmotonika 6 be dia be (200 μM) dia mamokatra faka fohy kokoa sy miolikolika havia (θ = - 23.7 ± 6.1), fa ny zana-ketsa maniry amin'ny fitaovana fanaraha-maso, ny ny zana-kazo dia namokatra fakany saika mahitsy (θ = – 3.8 ± 7.1).Ity fitomboan'ny oblique mampiavaka ity dia fantatra fa vokatry ny tsy fahampian'ny microtubule cortical14,18.Mifanaraka amin'io fikarohana io, ny disopyramide sy ny oryzalin izay manimba ny microtubule dia nahatonga ny fakany mitongilana eo ambanin'ny toetry ny fitomboantsika (sary 2b, 6a).Nandritra izany fotoana izany, nanandrana ny derivatives amin'ny asidra urmotonika izahay ary nisafidy maromaro tamin'izy ireo izay, tamin'ny fifantohana sasany, dia nahatonga ny fitomboan'ny fakany oblique.Ny fitambarana 8, 9, ary 15 dia nanova ny lalan'ny fitomboan'ny fakany amin'ny 75 μM, 50 μM, ary 40 μM, izay manondro fa ireo fitambarana ireo dia afaka manimba ny microtubule amin'ny fomba mahomby (sary 2b, 6a).Nosedrainay ihany koa ny derivative asidra ursolika mahery indrindra, KAND 11, amin'ny fifantohana ambany kokoa (15 µM) ary hita fa nanakana ny fitomboan'ny fakany ny fampiharana ny KAND 11 ary tsy mitovy ny fitarihan'ny fitomboan'ny faka, na dia nirona miankavia aza izy ireo ( Sary C3)..Satria ny fatran'ny zava-mahadomelina manimba ny microtubule dia manakana ny fitomboan'ny zavamaniry fa tsy miteraka fakan-kazo, dia nodinihinay avy eo ny mety ho fiantraikan'ny KAND 11 amin'ny microtubules amin'ny fijerena microtubules cortical ao amin'ny sela epidermis faka.Ny immunohistochemistry amin'ny fampiasana antibody anti-β-tubulin ao amin'ny sela epidermis amin'ny fakan'ny zana-kazo voatsabo amin'ny 25 μM KAND 11 dia nampiseho ny fanjavonan'ny saika microtubules cortical rehetra ao amin'ny sela epidermis ao amin'ny faritra elongation (sary 6b).Ireo vokatra ireo dia manondro fa ny asidra kumamotonika sy ny derivatives dia miasa mivantana na ankolaka amin'ny microtubules mba hanakorontanana azy ireo ary ireo fitambarana ireo dia mpikatroka microtubule vaovao.
Ny asidra ursonic sy ny derivatives dia manova ny microtubule cortical ao amin'ny Arabidopsis thaliana.(a) Ny zoro fironan'ny fakany dia refesina amin'ny fisian'ny derivatives asidra urmotonika isan-karazany amin'ny fifantohana voalaza.Nodinihina ihany koa ny fiantraikan'ny zavatra roa fantatra fa manakana ny microtubules: disopyramide sy oryzalin.Ny inset dia mampiseho ny fenitra ampiasaina handrefesana ny zoro fitomboan'ny faka.Ny asterisk dia manondro fahasamihafana lehibe amin'ny fitsaboana saro-pantarina (t test, p<0.05).n>19. Scale bar = 1 sm.(b) microtubules cortical ao amin'ny sela epidermis ao amin'ny faritra elongation.Ny microtubules amin'ny karazana Arabidopsis Col fakan'ny bibidia maniry amin'ny takelaka MS misy na tsy misy 25 μM KAND 11 dia naseho tamin'ny alàlan'ny fandokoana immunohistochemical amin'ny fampiasana antikora voalohany β-tubulin sy ny antikora faharoa mitambatra Alexa Fluor-conjugated.Scale bar = 10 µm.(c) Firafitry ny mitotika ny microtubule ao amin'ny meristem fakany.Ny microtubules dia nojerena tamin'ny fampiasana fandokoana immunohistochemical.Ny rafitra mitotika, anisan'izany ny faritra prophase, spindles ary phragmoplasts, dia voaisa tamin'ny sary confocal.Ny zana-tsipìka dia manondro firafitry ny microtubule mitotika.Ny asterisk dia manondro fahasamihafana lehibe amin'ny fitsaboana saro-pantarina (t test, p<0.05).n>9. Bara mizana = 50 µm.
Na dia afaka manakorontana ny fiasan'ny microtubule aza i Ursa, ny fomba fiasany dia antenaina fa tsy mitovy amin'ny microtubule depolymerizing agents mahazatra.Ohatra, ny fifantohana ambony kokoa amin'ny microtubule depolymerizing agents toy ny disopyramide sy oryzalin dia miteraka anisotropika ny sela epidermis, fa ny KAND 11 dia tsy.Ankoatr'izay, ny fiaraha-miasa amin'ny KAND 11 sy ny disopyramide dia nahatonga ny valin'ny fitomboan'ny fakan-tsarimihetsika disopyramide ary ny fihenan'ny fitomboan'ny KAND 11 dia voamarika (sary S4).Nodinihinay koa ny valin'ny disopyramide hypersensitive 1-1 (phs1-1) mutant amin'ny KAND 11. Ny phs1-1 dia manana mutation point tubulin kinase tsy kanônika ary mamokatra faka fohy kokoa rehefa tsaboina amin'ny disopyramide9,20.Ny zana-kazo mutant phs1-1 nambolena tamin'ny media agar misy KAND 11 dia fohy kokoa ny fakany mitovy amin'ireo nambolena tamin'ny disopyramida (sary S5).
Ankoatra izany, dia nandinika ny rafitra microtubule mitotic izahay, toy ny faritra prophase, spindles, ary phragmoplasts, ao amin'ny meristem fakan'ny zana-kazo tsaboina amin'ny KAND 11. Mifanaraka amin'ny fandinihana ho an'ny CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, fihenam-bidy lehibe amin'ny ny isan'ny microtubules mitotic dia voamarika (sary 6c).
Mba hamaritana ny cytotoxicity an'ny KAND 11 amin'ny famahana ny subcellular, dia notsaboinay ny sela fampiatoana paraky BY-2 miaraka amin'ny KAND 11 ary nandinika ny valinteniny.Nampidirinay voalohany ny KAND 11 amin'ny sela BY-2 izay maneho ny TagRFP-TUA6, izay mametaka ny microtubule amin'ny fluorescently, mba hanombanana ny fiantraikan'ny KAND 11 amin'ny microtubules cortical.Ny hakitroky ny microtubule cortical dia nodinihina tamin'ny fampiasana famakafakana sary, izay nanombantombana ny isan-jaton'ny pixel cytoskeletal eo amin'ny pixel cytoplasmic.Ny valin'ny assay dia naneho fa taorian'ny fitsaboana tamin'ny 50 μM na 100 μM KAND 11 nandritra ny 1 ora, dia nihena be ny hakitroky ho 0.94 ± 0.74% na 0.23 ± 0.28%, raha ny hakitroky ny sela voatsabo amin'ny DMSO, dia 1.61 ± 0.34. % (sary 7a).Ireo vokatra ireo dia mifanaraka amin'ny fandinihana ao amin'ny Arabidopsis fa ny fitsaboana KAND 11 dia miteraka depolymerization ny microtubules cortical (sary 6b).Nodinihinay ihany koa ny tsipika BY-2 miaraka amin'ny filaments actin misy marika GFP-ABD taorian'ny fitsaboana miaraka amin'ny fifantohana mitovy amin'ny KAND 11 ary nahatsikaritra fa ny fitsaboana KAND 11 dia nanakorontana ny filaments actin.Fitsaboana amin'ny 50 μM na 100 μM KAND 11 nandritra ny 1 h dia nihena be ny hakitroky ny filament actin ho 1.20 ± 0.62% na 0.61 ± 0.26%, tsirairay avy, fa ny hakitroky ao amin'ny DMSO-tsaboina sela dia 1.69 ± 0.51% (Fig.7b).Ireo vokatra ireo dia mifanohitra amin'ny vokatry ny propyzamide, izay tsy misy fiantraikany amin'ny filaments actin, ary latrunculin B, depolymerizer actin izay tsy misy fiantraikany amin'ny microtubules (SI Figure S6).Ankoatra izany, ny fitsaboana amin'ny coumamonamide 1, ny asidra coumamonamide 6, na ny KAND 11 dia tsy misy fiantraikany amin'ny microtubule ao amin'ny sela HeLa (SI Figure S7).Noho izany, ny fomba fiasan'ny KAND 11 dia inoana fa tsy mitovy amin'ny an'ireo mpanakorontana cytoskeleton fantatra.Ankoatr'izay, ny fandinihanay mikroskopika momba ny sela BY-2 tsaboina amin'ny KAND 11 dia nanambara ny fiandohan'ny fahafatesan'ny sela nandritra ny fitsaboana KAND 11 ary naneho fa tsy nitombo be ny isan'ny sela maty miloko manga Evans taorian'ny 30 min tamin'ny fitsaboana KAND 11, fa aorian'ny 90 minitra fitsaboana amin'ny 50 μM na 100 μM KAND, dia nitombo ho 43,7% na 80,1% ny isan'ny sela maty (sary 7c).Raha atambatra, ireo angon-drakitra ireo dia manondro fa ny KAND 11 derivative asidra ursolika dia singa cytoskeletal manokana amin'ny zavamaniry miaraka amin'ny fomba fiasa tsy fantatra taloha.
Ny KAND dia misy fiantraikany amin'ny microtubule cortical, filament actin, ary ny fahafahan'ny sela BY-2 paraky.(a) Famaritana ny microtubules cortical ao amin'ny sela BY-2 eo anatrehan'ny TagRFP-TUA6.Ny sela BY-2 notsaboina tamin'ny KAND 11 (50 μM na 100 μM) na DMSO dia nodinihina tamin'ny mikroskopika confocal.Ny hakitroky ny microtubule cortical dia kajy avy amin'ny micrographs amin'ny sela tsy miankina 25.Ny litera dia manondro fahasamihafana lehibe (fitsapana Tukey HSD, p<0.05).Scale bar = 10 µm.(b) Filaments cortical actin ao amin'ny sela BY-2 hita maso eo anatrehan'ny GFP-ABD2.Ny sela BY-2 notsaboina tamin'ny KAND 11 (50 μM na 100 μM) na DMSO dia nodinihina tamin'ny mikroskopika confocal.Ny hakitroky ny filamenta aktin cortical dia kajy avy amin'ny micrographs ny 25 tsy miankina sela.Ny litera dia manondro fahasamihafana lehibe (fitsapana Tukey HSD, p<0.05).Scale bar = 10 µm.(c) Fijerena ny sela BY-2 maty tamin'ny fandokoana manga Evans.Ny sela BY-2 notsaboina tamin'ny KAND 11 (50 μM na 100 μM) na DMSO dia nodinihina tamin'ny mikroskopika mamirapiratra.n=3.Scale bar = 100 µm.
Ny fahitana sy ny fampiharana ny vokatra voajanahary vaovao dia nitarika fandrosoana lehibe amin'ny lafiny samihafa amin'ny fiainan'ny olombelona, anisan'izany ny fitsaboana sy ny fambolena.Ny fikarohana ara-tantara dia natao mba hahazoana ireo akora mahasoa avy amin'ny harena voajanahary.Indrindra indrindra, ny actinomycetes dia fantatra fa ilaina amin'ny antibiotika antiparasitika ho an'ny nematodes noho ny fahafahany mamokatra metabolites faharoa isan-karazany toy ny avermectin, ny fitambaran'ny ivermectin sy bleomycin ary ny derivatives, ampiasaina amin'ny fitsaboana ho toy ny anticancer agent21,22.Toy izany koa, karazana herbicidal isan-karazany no hita avy amin'ny actinomycetes, ny sasany dia efa nampiasaina ara-barotra1,23.Noho izany, ny famakafakana ny metabolites actinomycete mba hitoka-monina ny vokatra voajanahary miaraka amin'ny hetsika biolojika irina dia heverina ho paikady mahomby.Tamin'ity fanadihadiana ity dia nahita fitambarana vaovao, coumamonamide, avy amin'ny S. werraensis izahay ary nahomby tamin'ny synthesize azy.Ny asidra ursonic dia mpanelanelana synthetic amin'ny urbenamide sy ny derivatives.Mety miteraka fikorotanana ny fakany, mampiseho hetsika herbicidal antonony ka hatramin'ny mahery, ary manimba mivantana na ankolaka ny microtubule amin'ny zavamaniry.Na izany aza, ny fomba fiasan'ny asidra urmotonika dia mety tsy mitovy amin'ny an'ny microtubule inhibitors efa misy, satria ny KAND 11 dia manakorontana ny filaments actin ary mahatonga ny fahafatesan'ny sela, manoro hevitra ny rafitra mifehy ny asidra urmotonika sy ny derivatives misy fiantraikany amin'ny rafitra cytoskeletal marobe..
Ny famaritana amin'ny antsipiriany bebe kokoa momba ny asidra urbenônika dia hanampy amin'ny fahatakarana tsara kokoa ny fomba fiasan'ny asidra urbenônika.Indrindra indrindra, ny tanjona manaraka dia ny fanombanana ny fahafahan'ny asidra ursonic mifatotra amin'ny microtubules mihena mba hamaritana raha ny asidra ursonic sy ny derivatives dia miasa mivantana amin'ny microtubules ary manala azy ireo, na ny hetsika ataon'izy ireo dia miteraka fikorontanan'ny microtubule.Ankoatr'izay, amin'ny tranga izay tsy lasibatra mivantana ny microtubules, ny famantarana ny toerana misy ny hetsika sy ny molekiola lasibatra amin'ny asidra ursonic amin'ny selan'ny zavamaniry dia hanampy amin'ny fahatakarana bebe kokoa ny fananan'ny fitambarana mifandraika sy ny fomba mety hanatsarana ny hetsika herbicidal.Ny fitiliana bioactivity nataonay dia nanambara ny fahaizan'ny cytotoxic tsy manam-paharoa amin'ny asidra ursonic amin'ny fitomboan'ny zavamaniry toy ny Arabidopsis thaliana, paraky ary atiny, raha toa ka tsy nisy fiantraikany ny sela E. coli na HeLa.Ny poizina kely na tsy misy poizina amin'ny selan'ny biby dia tombony azo avy amin'ny asidra ursonic raha novolavolaina ho herbicide ampiasaina amin'ny sehatry ny fambolena misokatra.Eny tokoa, satria rafitra mahazatra ao amin'ny eukaryotes ny microtubules, ny fanakanana ny zavamaniry dia tena ilaina amin'ny herbicides.Ohatra, propyzamide, microtubule depolymerizing agent izay mifatotra mivantana amin'ny tubulin ary manakana ny polymerization, dia ampiasaina ho herbicide noho ny poizina ambany amin'ny sela biby24.Mifanohitra amin'ny disopyramide, ny benzamides mifandraika dia manana tanjona voafaritra manokana.Ankoatra ny microtubule amin'ny zavamaniry, ny RH-4032 na benzoxamide dia manakana ny microtubules amin'ny sela biby na oomycetes, ary ny zalilamide dia ampiasaina ho fungicide noho ny phytotoxicity ambany25,26,27.Ny orsa vao hita sy ny vokatra azony dia mampiseho cytotoxicity mifantina amin'ny zavamaniry, saingy tsara ny manamarika fa ny fanovana fanampiny dia mety hanova ny maha-tokana azy, izay mety hanome derivative fanampiny amin'ny fifehezana ny holatra pathogen na oomycetes.
Ny fananana tsy manam-paharoa amin'ny asidra urbenônika sy ny vokatra azony dia ilaina amin'ny fivoarany ho herbicides ary ampiasaina ho fitaovana fikarohana.Ny maha-zava-dehibe ny cytoskeleton amin'ny fanaraha-maso ny endriky ny selan'ny zavamaniry dia fantatra be.Ny fanadihadiana teo aloha dia naneho fa ny zavamaniry dia namolavola rafitra sarotra amin'ny fikambanan'ny microtubule cortical amin'ny alàlan'ny fifehezana ny dinamika microtubule mba hifehezana tsara ny morphogenesis.Maro ny molekiola tompon'andraikitra amin'ny fanaraha-maso ny hetsika microtubule no fantatra, ary mbola mitohy ny fikarohana mifandraika amin'izany3,4,28.Ny fahatakarantsika amin'izao fotoana izao ny dinamika microtubule amin'ny selan'ny zavamaniry dia tsy manazava tanteraka ny fomba fiasan'ny fikambanan'ny microtubule cortical.Ohatra, na dia ny disopyramide sy ny oryzalin aza dia afaka manafoana ny microtubules, ny disopyramide dia miteraka fikorontanan'ny fakany mafy ary ny oryzalin dia manana fiantraikany malefaka.Ankoatra izany, ny fiovana ao amin'ny tubulin, izay mampitony ny microtubule, dia miteraka dextrorotation amin'ny fakany, fa ny paclitaxel, izay manamafy ny dinamika microtubule, dia tsy.Noho izany, ny fandalinana sy ny famantarana ny molekiola kendrena amin'ny asidra ursolika dia tokony hanome fomba fijery vaovao momba ny fifehezana ny microtubule cortical zavamaniry.Toy izany koa, ny fampitahana amin'ny ho avy amin'ny akora simika izay mahomby amin'ny fampiroboroboana ny fitomboana mikorontana, toy ny disopyramide, sy ny zavatra simika tsy dia mahomby, toy ny oryzalin na ny asidra kumamotorika, dia hanome fanazavana momba ny firongatry ny fitomboana.
Amin'ny lafiny iray, ny fanovana cytoskeletal mifandraika amin'ny fiarovana dia mety hafa hanazavana ny cytotoxicity ny asidra ursonic.Ny fifindran'ny otrikaretina na ny fampidirana elicitor ao amin'ny selan'ny zavamaniry indraindray dia miteraka fahapotehan'ny cytoskeleton sy fahafatesan'ny sela manaraka29.Ohatra, ny cryptoxanthin avy amin'ny oomycete dia voalaza fa manakorontana ny microtubules sy ny filaments actin alohan'ny fahafatesan'ny sela paraky, mitovy amin'ny zava-mitranga amin'ny fitsaboana KAND30,31.Ny fitoviana misy eo amin'ny valin'ny fiarovana sy ny valin'ny sela ateraky ny asidra ursonic dia nahatonga antsika hihevitra fa miteraka fizotry ny sela mahazatra izy ireo, na dia miharihary aza ny fiantraikany haingana sy mahery kokoa amin'ny asidra ursonic noho ny cryptoxanthin.Na izany aza, ny fanadihadiana dia naneho fa ny fikorontanan'ny filaments actin dia mampiroborobo ny fahafatesan'ny sela ho azy, izay tsy miaraka amin'ny fikorontanan'ny microtubule29.Ankoatra izany, mbola ho hita raha ny pathogen na ny elicitor no mahatonga ny fitomboan'ny fakany, toy ny derivatives amin'ny asidra ursonic.Noho izany, ny fahalalana molekiola mampifandray ny valin'ny fiarovana sy ny cytoskeleton dia olana mahaliana tokony hodinihina.Amin'ny fanararaotana ny fisian'ny fitambaran'ny lanja molekiola ambany mifandraika amin'ny asidra ursonic, ary koa ny karazana derivatives manana hery samihafa, dia mety hanome fahafahana hikendry mekanika sela tsy fantatra izy ireo.
Raha atambatra, ny fikarohana sy ny fampiharana ny kapoaly vaovao izay manova ny dinamika microtubule dia hanome fomba mahery vaika hamahana ireo mekanika molekiola saro-pady izay mamaritra ny endriky ny sela zavamaniry.Amin'ity toe-javatra ity, ny asidra urmotonika vao haingana novolavolaina, izay misy fiantraikany amin'ny microtubule sy ny filament actin ary miteraka fahafatesan'ny sela, dia mety hanome fahafahana hamantatra ny fifandraisana misy eo amin'ny fifehezana microtubule sy ireo mekanika hafa ireo.Noho izany, ny famakafakana simika sy biolojika mampiasa asidra urbenônika dia hanampy antsika hahatakatra ny rafitra mifehy ny molekiola mifehy ny cytoskeleton zavamaniry.
Atsipazo ny S. werraensis MK493-CF1 ao anaty tavoahangy Erlenmeyer 500 mL misy savorovoro misy 110 mL fangaro voa misy 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) pasteur Essence, 1% ( w/v) Bacto composition .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) katsaka (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 ary 0,2% CaCO3 amin'ny rano deionized.(pH 7.4 alohan'ny sterilization).Ny kolontsaina voa dia natsofoka tamin'ny rotary shaker (180 rpm) tamin'ny 27 ° C nandritra ny 2 andro.Fambolena famokarana amin'ny alàlan'ny fermentation solide.Ny kolontsaina voa (7 ml) dia nafindra tao anaty tavoahangy K-1 500 ml misy 40 g ny fitaovana famokarana misy 15 g ny vary orza (MUSO Co., Ltd., Japana) ary 25 g ny rano deionized (pH tsy voarindra. alohan'ny sterilization).).Ny fermentation dia natao tamin'ny 30 ° C tao anaty haizina nandritra ny 14 andro.Ny fitaovana fermentation dia nalaina tamin'ny 40 ml / tavoahangy EtOH ary centrifuged (1500 g, 4 ° C, 10 min).Ny supernatant kolontsaina (60 ml) dia nalaina tamin'ny fifangaroan'ny 10% MeOH / EtOAc.Ny sosona organika dia nopotehina tamin'ny fanerena mihena mba hahazoana sisa tavela (59.5 mg), izay iharan'ny HPLC miaraka amin'ny gradient elution (0-10 minitra: 90%) amin'ny tsanganana mivadika (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × halavany 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minitra: 90% H2O/CH3CN hatramin'ny 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minitra: 90% H2O/EtOH, 45–155 minitra: 90% H2O / EtOH hatramin'ny 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) amin'ny tahan'ny fikorianan'ny 1.5 ml / min, ny coumamonamide (1, 36.0 mg) dia natokana ho vovoka amorphous fotsy.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ sanda voaisa: 141.0659, sanda refesina: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593–1533 cm
Ny masomboly Columbia (Col-0) dia azo avy amin'ny Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) nahazoana alalana hampiasaina amin'ny fikarohana.Ny voan'ny Col-0 dia naparitaka sy nokolokoloina tao anatin'ny toe-javatra iainan'ny laboratoara ary nampiasaina ho zavamaniry Arabidopsis karazana bibidia.Ny masomboly Arabidopsis dia nodiovina tamin'ny tany ary nokolokoloina tamin'ny Murashige sy Skoog medium misy 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w / v) 2- (4-morpholino) asidra etanesulfonic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) ary 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, amin'ny 23 °C ary hazavana tsy tapaka.Ny voan'ny mutant phs1-1 dia nomen'i T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Ny voan'ny strain SR-1 dia nomen'i T. Hashimoto (Institut momba ny Siansa sy ny Teknolojia Nara) ary nampiasaina ho zavamaniry paraky.Ny voan'ny paraky dia nodiovina tamin'ny tany ary natsofoka tamin'ny rano maloto nandritra ny telo alina mba hampiroboroboana ny fitsimohany, avy eo dia napetraka ao anaty vahaolana matanjaka misy 2% sucrose, 0,05% (w/v) MES, ary 0,8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.ary Skoog medium) miaraka amin'ny pH 5,7 ary incubated amin'ny 23 ° C amin'ny hazavana tsy tapaka.
Ny Strain Tak-1 dia nomen'i T. Kohchi (University Kyoto) ary nampiasaina ho toy ny vondrona fanandramana mahazatra ho an'ny fandalinana ny atiny.Ny Gemma dia azo avy amin'ny zava-maniry kolontsaina sterilized ary avy eo nopetahana tamin'ny fitaovana Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) misy 1% sucrose sy 0,3% gellan gum ary natsofoka tamin'ny 23 ° C eo ambanin'ny hazavana mitohy.
Ny sela paraky BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Mavo Mavo 2) dia nomen'i S. Hasezawa (University of Tokyo).Ny sela BY-2 dia nalevina in-95 heny tao amin'ny medium Linsmeier sy Skoog novaina ary nampiana asidra 2,4-dichlorophenoxyacetic 32 isan-kerinandro.Ny fampiatoana sela dia nafangaro tamin'ny rotary shaker amin'ny 130 rpm amin'ny 27 ° C ao anaty haizina.Sasao amin'ny 10 heny ny habetsahan'ny sela vaovao ary avereno amin'ny fitaovana mitovy.BY-2 tsipika sela transgenika stably maneho ny microtubule marika TagRFP-TUA6 na ny actin filament marker GFP-ABD2 eo ambanin'ny cauliflower mosaic viriosy 35S mpanentana dia novokarina araka ny voalaza33,34,35.Ireo tsipika sela ireo dia azo tazonina sy ampifanarahina amin'ny fampiasana fomba fiasa mitovy amin'ny an'ny tsipika sela BY-2 tany am-boalohany.
Ny sela HeLa dia novolavolaina tao amin'ny Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) nampian'ny 10% foetal bovine serum, 1.2 U / ml penicillin, ary 1.2 μg / ml streptomycin ao anaty incubator 37 ° C miaraka amin'ny 5% CO2.
Ny fanandramana rehetra voalaza ato amin'ity sora-tanana ity dia natao mifanaraka amin'ny fitsipika sy torolàlana momba ny biosafety japoney.
Ny fitambarana dia levona amin'ny dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ho toy ny vahaolana stock ary nalevina tao amin'ny medium MS ho an'ny Arabidopsis sy paraky na Gamborg B5 medium ho an'ny atiny.Ho an'ny fitsirihana ny fihanaky ny fitomboan'ny faka dia voa mihoatra ny 10 isaky ny lovia no nafafy tamin'ny media agar misy ny fitambarana voalaza na DMSO.Ny voa dia natsofoka tao amin'ny efitrano fitomboana nandritra ny 7 andro.Nalaina sary ny zana-kazo ary norefesina ny halavan’ny fakany.Ho an'ny fitsirihana ny tsimok'aretina Arabidopsis, voa 48 isaky ny takelaka dia nafafy tamin'ny media agar misy 200 μM na DMSO.Ny masomboly Arabidopsis dia nambolena tao amin'ny efitrano fitomboana ary isaina ny isan'ny zana-kazo mitsimoka 7 andro aorian'ny fitsimohany (dag).Ho an'ny fitsindronan'ny paraky, voa 24 isaky ny takelaka dia nafafy tamin'ny medium agar misy 200 μM KAND na DMSO.Nambolena tao anaty efitra fatoriana ny masomboly paraky ary isaina ny isan’ny zana-kazo nitsimoka rehefa afaka 14 andro.Ho an'ny fitsirihana ny fihenan'ny fitomboan'ny atiny, ny embryon 9 avy amin'ny takelaka tsirairay dia nopetahana tamin'ny media agar misy ny fifantohana KAND na DMSO voatondro ary natsipy tao anaty efitrano fitomboana nandritra ny 14 andro.
Mampiasà zana-kazo voaloto amin'ny 5 mg/ml propidium iodide (PI) mba hijerena ny firafitry ny meristem fakany.Ny mari-pamantarana PI dia nojerena tamin'ny microscopy fluorescence tamin'ny fampiasana microscope scanning laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Ny fandokoana histochemical ny fakany amin'ny β-glucuronidase (GUS) dia natao araka ny protocole nofaritan'i Malami sy Benfey36.Ny zana-ketsa dia napetraka amin'ny acetone 90% mandritra ny alina, voaloto amin'ny 0,5 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid ao anaty buffer GUS mandritra ny adiny 1 ary napetraka ao anaty vahaolana chloraldehyde hydrated.(8 g hydrate chloral, rano 2 ml ary glycerol 1 ml) ary voamariky ny microscopy contrast interference difference amin'ny fampiasana mikraoskaopy Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Norefesina ny zoro fakany tamin'ny zana-kazo 7 andro nambolena teo amin'ny takelaka mitsangana.Refesina ny zoro ny fakany avy amin'ny lalan'ny gravity vector araka ny voalaza ao amin'ny dingana 6.
Ny fandaminana ny microtubules cortical dia voamarika araka ny voalaza, miaraka amin'ny fanovana kely amin'ny protocol 37.Antibody anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) sy Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) dia nampiasaina ho antikora voalohany sy faharoa amin'ny 1: 1000 sy 1: 100 dilutions, tsirairay avy.Ny sary fluorescence dia azo tamin'ny alàlan'ny TCS SPE confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems).Mahazoa sary Z-stack ary mamorona vinavina mahery vaika indrindra araka ny torolalan'ny mpanamboatra.
Ny fitiliana ny fihanaky ny sela HeLa dia natao tamin'ny fampiasana Cell Counting Kit 8 (Dojindo) araka ny torolalan'ny mpanamboatra.
Ny fitomboan'ny E. coli DH5α dia nodinihina tamin'ny fandrefesana ny haavon'ny sela amin'ny kolontsaina mampiasa spectrophotometer amin'ny 600 nm (OD600).
Ny fikambanan'ny cytoskeletal amin'ny sela BY-2 transgenika dia nojerena tamin'ny alàlan'ny mikraoskaopy fluorescence miaraka amin'ny fitaovana fitiliana confocal CSU-X1 (Yokogawa) ary fakantsary sCMOS (Zyla, Andor Technology).Ny hakitroky ny cytoskeletal dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny famakafakana sary, izay nanombantombana ny isan-jaton'ny pixel cytoskeletal eo amin'ny pixel cytoplasmic amin'ny sary confocal mampiasa rindrambaiko ImageJ araka ny voalaza38,39.
Mba hamantarana ny fahafatesan'ny sela ao amin'ny sela BY-2, ny aliquot iray amin'ny fampiatoana sela dia natsipy tamin'ny 0.05% Evans manga nandritra ny 10 minitra tamin'ny mari-pana.Ny fandokoana manga amin'ny sela maty Evans dia miankina amin'ny fivoahana ny loko avy amin'ny sela velona amin'ny alàlan'ny membrane plasma tsy misy dikany40.Ny sela voaloto dia nojerena tamin'ny alàlan'ny mikraoskaopy mamirapiratra (BX53, Olympus).
Ny sela HeLa dia nitombo tao amin'ny DMEM nampian'ny 10% FBS tao amin'ny incubator humidified amin'ny 37 ° C sy 5% CO2.Ny sela dia notsaboina tamin'ny 100 μM KAND 11, asidra kumamonamika 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco), na 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) mandritra ny 6 ora amin'ny 37 ° C.Ny sela dia napetraka amin'ny MetOH mandritra ny 10 min ary avy eo amin'ny acetate mandritra ny 5 min amin'ny mari-pana.Ny sela raikitra dia natsipy tamin'ny antibody voalohany β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) voadio tamin'ny 0.5% BSA / PBS nandritra ny ora 2, nosasana in-3 tamin'ny TBST, ary avy eo dia natsipy tamin'ny Alexa Fluor goat antibody.4881 ora.- Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ary 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) voadio amin'ny 0,5% BSA/PBS.Rehefa avy nosasana tamin'ny TBST in-telo, dia hita tamin'ny microscope nivadika Nikon Eclipse Ti-E ny sela voaloto.Ny sary dia nalaina tamin'ny fakan-tsary Hamamatsu ORCA-R2 CCD mangatsiaka tamin'ny fampiasana rindrambaiko MetaMorph (Molecular Devices).
Fotoana fandefasana: Jun-17-2024