Ny fitomboan'ny meristem apical (SAM) dia tena zava-dehibe amin'ny maritrano. Zavamaniry hormoninagibberellin(GA) dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny fandrindrana ny fitomboan'ny zavamaniry, saingy mbola tsy takatry ny saina ny anjara asany ao amin'ny SAM. Eto izahay dia namolavola biosensor ratiometric amin'ny famantarana GA amin'ny alàlan'ny famolavolana ny proteinina DELLA mba hanakanana ny asany ara-dalàna manan-danja amin'ny valin'ny transcriptional GA ary miaro ny fahapotehany amin'ny fanekena GA. Asehonay fa ity biosensor mifototra amin'ny fahasimbana ity dia mirakitra marina ny fiovan'ny haavon'ny GA sy ny fahatsapana sela mandritra ny fampandrosoana. Nampiasa ity biosensor ity izahay mba hametahana ny hetsika famantarana GA ao amin'ny SAM. Asehontsika fa ny mari-pamantarana GA avo dia hita ao amin'ny sela misy eo anelanelan'ny primordia organ, izay mpialoha lalana ny sela internode. Amin'ny fampiasana fomba fiasa hahazoana tombony sy fatiantoka, dia asehontsika bebe kokoa fa ny GA dia manara-maso ny fizotry ny fiaramanidina fizarana sela, mametraka ny fikambanan'ny sela kanonika amin'ny internodes, ka mampiroborobo ny famaritana internode ao amin'ny SAM.
Ny tifitra apical meristem (SAM), izay hita eo amin'ny tendron'ny tifitra, dia misy sela misy sela misy sela izay miteraka taova lateral sy nodes amin'ny fomba modular sy miverimberina mandritra ny androm-piainan'ny zavamaniry. Ny tsirairay amin'ireo singa miverimberina ireo, na ny node zava-maniry, dia ahitana internodes sy taova lateral amin'ny node, ary meristem axillary ao amin'ny axils ravina1. Miova ny fitomboana sy ny fandaminana ny vodin'ny zavamaniry mandritra ny fampandrosoana. Ao amin'ny Arabidopsis, ny fitomboan'ny internodal dia voatsindry mandritra ny dingan'ny vegetative, ary ny meristem axillary dia mijanona ao amin'ny axils amin'ny ravina rosette. Mandritra ny fifindrana mankany amin'ny vanim-potoan'ny voninkazo, ny SAM dia lasa meristem inflorescence, miteraka internode lava sy tsimokaretina axillary, sampana amin'ny axils amin'ny ravina cauline, ary avy eo, voninkazo tsy misy ravina2. Na dia nanao fandrosoana lehibe aza izahay tamin'ny fahatakarana ny fomba mifehy ny fanombohan'ny ravina, ny voninkazo ary ny sampany, dia tsy dia fantatra loatra ny momba ny fiposahan'ny internodes.
Ny fahatakarana ny fizarana spatiotemporal ny GA dia hanampy amin'ny fahatakarana bebe kokoa ny asan'ireo hormones ireo amin'ny tavy samihafa sy amin'ny dingana fampandrosoana samihafa. Ny fijerena ny fahapotehan'ny fusion RGA-GFP aseho eo ambanin'ny fihetsiky ny mpanentana azy manokana dia manome fampahalalana manan-danja momba ny fifehezana ny totalin'ny GA amin'ny roots15,16. Na izany aza, ny fanehoana RGA dia miovaova amin'ny tissues17 ary fehezin'ny GA18. Noho izany, ny fanehoana ny tsy fitoviana amin'ny mpanentana RGA dia mety miteraka ny lamina fluorescence hita amin'ny RGA-GFP ary noho izany dia tsy voavaly io fomba io. Vao haingana, ny bioactive fluorescein (Fl) -labeled GA19,20 dia nanambara ny fivondronan'ny GA ao amin'ny endocortex fakany sy ny fifehezana ny haavon'ny sela amin'ny alàlan'ny fitaterana GA. Vao haingana, ny sensor GA FRET nlsGPS1 dia naneho fa ny haavon'ny GA dia mifandray amin'ny fanitaran'ny sela amin'ny fakany, filamenta ary hypocotyls21. Na izany aza, araka ny efa hitantsika, ny fifantohana GA dia tsy ny mari-pamantarana mifehy ny hetsika famantarana GA, satria miankina amin'ny fizotry ny fahatsapana sarotra izany. Eto, miorina amin'ny fahatakarantsika ny lalana famantarana DELLA sy GA, dia mitatitra ny fivoarana sy ny toetran'ny biosensor ratiometric mifototra amin'ny fahasimbana ho an'ny famantarana GA. Mba hampivelarana io biosensor quantitative io dia nampiasa RGA mutant GA-sensitive izahay izay natambatra tamin'ny proteinina fluorescent ary naseho hatraiza hatraiza tamin'ny tavy, ary koa proteinina fluorescent GA-insensitive. Asehontsika fa ny fifangaroan'ny proteinina RGA mutant dia tsy manelingelina ny famantarana GA endogenous rehefa aseho amin'ny fomba rehetra, ary io biosensor io dia afaka manombatombana ny hetsika famantarana vokatry ny fampidirana GA sy ny fanodinana famantarana GA amin'ny alàlan'ny fitaovana sensing miaraka amin'ny fanapahan-kevitra spatiotemporal avo lenta. Nampiasa an'io biosensor io izahay mba hametahana ny fizarana spatiotemporal ny hetsika famantarana GA ary hamaritana ny fomba ifehezan'ny GA ny fitondran-tenan'ny sela ao amin'ny epiderme SAM. Asehontsika fa ny GA dia manara-maso ny fizotry ny fiaramanidina fizarana ny sela SAM eo anelanelan'ny primordia organ, ka mamaritra ny fikambanan'ny sela kanonika amin'ny internode.
Farany, nanontany izahay raha afaka mitatitra ny fiovan'ny haavon'ny GA endogenous amin'ny fampiasana hypocotyls mitombo ny qmRGA. Nasehontsika teo aloha fa ny nitrate dia mandrisika ny fitomboana amin'ny fampitomboana ny synthesis GA ary, ho setrin'izany, ny fahasimban'ny DELLA34. Araka izany, hitanay fa ny halavan'ny hypocotyl ao amin'ny zana-kazo pUBQ10::qmRGA nambolena tamin'ny famatsiana nitrate be dia be (10 mM NO3−) dia lava kokoa noho ny an'ny zana-ketsa nambolena tao anatin'ny toe-javatra tsy ampy nitrate (Fig. 6a fanampiny). Mifanaraka amin'ny valin'ny fitomboana, ny mari-pamantarana GA dia ambony kokoa amin'ny hypocotyls amin'ny zana-ketsa nambolena teo ambanin'ny fepetra 10 mM NO3− raha oharina amin'ny zana-ketsa nambolena tamin'ny tsy fisian'ny nitrate (sary fanampiny 6b, c). Noho izany, ny qmRGA dia mamela ny fanaraha-maso ny fiovan'ny famantarana GA vokatry ny fiovan'ny endogenous amin'ny fifantohana GA.
Mba hahatakarana raha miankina amin'ny fifantohana GA sy ny fahitan'ny GA ny hetsika famantarana GA izay hitan'ny qmRGA, araka ny antenaina mifototra amin'ny famolavolana sensor, dia nandinika ny fanehoana ireo mpandray telo GID1 izahay amin'ny tavy vegetative sy ny fananahana. Ao amin'ny zana-ketsa, ny tsipika mpanao gazety GID1-GUS dia naneho fa ny GID1a sy c dia naseho tamin'ny cotyledons (sary 3a-c). Fanampin'izany, ireo mpandray telo rehetra dia naseho tamin'ny ravina, ny primordia fakany lateral, ny tendron'ny fakany (afa-tsy ny kapôtin'ny GID1b), ary ny rafitra vascular (sary 3a-c). Ao amin'ny inflorescence SAM, dia nahita famantarana GUS ho an'ny GID1b sy 1c ihany izahay (sary fanampiny 7a-c). Ny hybridization in situ dia nanamafy ireo endri-pitenenana ireo ary nampiseho bebe kokoa fa ny GID1c dia naseho tamin'ny ambaratonga ambany tao amin'ny SAM, fa ny GID1b kosa dia naneho fitenenana ambony kokoa teo amin'ny sisin'ny SAM (Amboaran-tsary fanampiny 7d-l). Ny pGID1b:: 2xmTQ2-GID1b translate fusion dia nanambara ihany koa ny karazana fanehoana GID1b, avy amin'ny ambany na tsy misy fanehoana eo afovoan'ny SAM mankany amin'ny fanehoana avo amin'ny sisin'ny taova (Fig. 7m fanampiny). Noho izany, ny mpandray ny GID1 dia tsy miparitaka manerana sy ao anaty tavy. Tamin'ny fanandramana manaraka, dia nahatsikaritra ihany koa izahay fa ny fanehoana tafahoatra ny GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) dia nampitombo ny fahatsapana ny qmRGA amin'ny hypocotyls amin'ny fampiharana GA ivelany (sary 3d, e). Mifanohitra amin'izany kosa, ny fluorescence refesina amin'ny qd17mRGA ao amin'ny hypocotyl dia tsy mahatsikaritra ny fitsaboana GA3 (sary 3f, g). Ho an'ny fitsapana roa, ny zana-ketsa dia notsaboina tamin'ny GA (100 μM GA3) avo lenta mba hanombanana ny fihetsika haingana ataon'ny sensor, izay nitombo na very ny fahafahana mamatotra ny mpandray ny GID1. Miara-manamafy ireo valiny ireo fa ny biosensor qmRGA dia miasa miaraka amin'ny sensor GA sy GA, ary manoro hevitra fa ny fanehoana tsy fitoviana amin'ny mpandray ny GID1 dia afaka manova be ny emissivity ny sensor.
Hatramin'izao, mbola tsy mazava ny fizarana ny famantarana GA ao amin'ny SAM. Noho izany, nampiasa zavamaniry fanehoana qmRGA sy ny pCLV3 :: mCherry-NLS stem cell reporter35 izahay mba hanombanana ny sarintany avo lenta amin'ny hetsika famantarana GA, mifantoka amin'ny sosona L1 (epidermis; Fig. 4a, b, jereo ny fomba sy ny fomba fanampiny), satria ny L1 dia manana anjara toerana lehibe amin'ny fanaraha-maso ny fitomboan'ny SAM36. Eto, pCLV3 :: mCherry-NLS fanehoan-kevitra dia nanome teboka fanondroana geometrika ho an'ny famakafakana ny fizarana spatiotemporal ny hetsika famantarana GA37. Na dia heverina ho tena ilaina amin'ny fivoaran'ny taova lateral4 aza ny GA, dia hitanay fa ambany ny mari-pamantarana GA ao amin'ny primordium floral (P) manomboka amin'ny dingana P3 (sary 4a, b), fa ny tanora P1 sy P2 primordiums dia manana hetsika antonony mitovy amin'ny any amin'ny faritra afovoany (sary 4a, b). Ny hetsika famantarana GA avo kokoa dia hita ao amin'ny sisin-tanin'ny organ primordium, manomboka amin'ny P1 / P2 (eo amin'ny sisin'ny sisin-tany) ary miakatra amin'ny P4, ary koa amin'ny sela rehetra amin'ny faritra periferika eo anelanelan'ny primordia (sary 4a, b ary Fig. 8a, b). Ity hetsika famantarana GA ambony ity dia tsy hita afa-tsy amin'ny epidermis fa ao amin'ny L2 sy ambony L3 sosona (fanampiny sary 8b). Ny lamin'ny mari-pamantarana GA hita ao amin'ny SAM mampiasa qmRGA dia mbola tsy niova ihany koa rehefa nandeha ny fotoana (Fig. 8c-f, k). Na dia nihena tsikelikely aza ny fananganana qd17mRGA tao amin'ny SAM an'ny zavamaniry T3 avy amin'ny andalana dimy tsy miankina izay nomarihinay tamin'ny antsipiriany, dia afaka nanadihady ny lamina fluorescence azo tamin'ny pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP construct (Fanampiana 8g-j, l). Ao amin'io tsipika fanaraha-maso io, ny fiovana kely fotsiny amin'ny tahan'ny fluorescence dia hita tao amin'ny SAM, fa tao amin'ny foibe SAM dia nahita fihenam-bidy mazava sy tsy nampoizina tao amin'ny VENUS mifandray amin'ny TagBFP izahay. Izany dia manamafy fa ny lamina famantarana hitan'ny qmRGA dia taratry ny fahasimban'ny GA-miankina amin'ny mRGA-VENUS, fa koa mampiseho fa ny qmRGA dia mety hanamaivana ny hetsika famantarana GA ao amin'ny foibe meristem. Raha fintinina, ny valim-pifidiananay dia mampiseho lamina famantarana GA izay maneho voalohany ny fizarana ny primordia. Ity fizarana ny faritra inter-primordial (IPR) ity dia noho ny fametrahana tsikelikely ny hetsika famantarana GA avo eo amin'ny fampandrosoana ny primordium sy ny faritra afovoany, ary miaraka amin'izay koa, mihena ny hetsika famantarana GA ao amin'ny primordium (sary 4c, d).
Ny fizarana ny GID1b sy ny GID1c receptors (jereo etsy ambony) dia manoro hevitra fa ny fanehoana ny fahasamihafana amin'ny mpandray GA dia manampy amin'ny famolavolana ny lamin'ny hetsika famantarana GA ao amin'ny SAM. Nanontany tena izahay raha mety ho tafiditra ao anatin'izany ny fanangonam-bokatra amin'ny GA. Mba hanadihadiana an'io fahafahana io dia nampiasa ny nlsGPS1 GA FRET sensor21 izahay. Ny fihenan'ny fampahavitrihana dia hita ao amin'ny SAM an'ny nlsGPS1 voatsabo amin'ny 10 μM GA4 + 7 mandritra ny 100 min (Fig. 9a-e fanampiny), izay manondro fa ny nlsGPS1 dia mamaly ny fiovan'ny fifantohana GA ao amin'ny SAM, toy ny ao amin'ny roots21. Ny fizarana spatial amin'ny fatran'ny fampahavitrihana nlsGPS1 dia nanambara ny haavon'ny GA somary ambany ao amin'ny sosona ivelany amin'ny SAM, saingy nampiseho fa nisondrotra teo afovoany sy teo amin'ny sisin-tanin'ny SAM (sary 4e sy fanampiny Fig. 9a, c). Izany dia manondro fa ny GA dia zaraina ao amin'ny SAM miaraka amin'ny lamina ara-potoana azo ampitahaina amin'ny nambaran'ny qmRGA. Ho toy ny fomba famenoana, dia noraisinay ihany koa ny SAM miaraka amin'ny fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) na Fl irery ho toy ny fanaraha-maso ratsy. Ny mari-pamantarana Fl dia nozaraina manerana ny SAM, anisan'izany ny faritra afovoany sy ny primordium, na dia ambany kokoa aza (sary 4j sy sary fanampiny 10d). Mifanohitra amin'izany kosa, ny GA-Fl telo dia niangona manokana tao anatin'ny sisintany primordium ary amin'ny ambaratonga samihafa amin'ny sisa amin'ny IPR, miaraka amin'ny GA7-Fl miangona ao amin'ny sehatra lehibe indrindra ao amin'ny IPR (sary 4k sy fanampiny Fig. 10a, b). Ny fampitomboana ny hamafin'ny fluorescence dia nanambara fa ny tahan'ny IPR amin'ny tsy IPR dia ambony kokoa amin'ny GA-Fl-treated SAM raha oharina amin'ny Fl-treated SAM (sary 4l sy fanampiny Fig. 10c). Ireo valiny ireo dia manondro fa ny GA dia eo amin'ny fifantohana ambony kokoa amin'ny sela IPR izay akaiky indrindra amin'ny sisin-tany. Izany dia manolo-kevitra fa ny lamin'ny hetsika famantarana SAM GA dia vokatry ny fanehoana tsy mitovy amin'ny mpandray ny GA sy ny fanangonam-bokatra GA amin'ny sela IPR akaikin'ny sisin'ny taova. Noho izany, ny famakafakana nataonay dia nanambara lamina spatiotemporal tsy nampoizina amin'ny famantarana GA, miaraka amin'ny hetsika ambany kokoa eo afovoany sy ny primordium ny SAM ary ny hetsika ambony ao amin'ny IPR ao amin'ny faritra periferika.
Mba hahatakarana ny anjara asan'ny hetsika fanamafisam-peo GA ao amin'ny SAM, dia nodinihinay ny fifandraisana misy eo amin'ny hetsika famantarana GA, ny fanitarana ny sela, ary ny fizarana sela amin'ny fampiasana sary an-tsary amin'ny fotoana tena izy amin'ny SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS. Raha jerena ny andraikitry ny GA amin'ny fandrindrana ny fitomboana, dia andrasana ny fifamatorana tsara amin'ny masontsivana fanitarana sela. Noho izany, dia nampitahainay aloha ny sarintanin'ny hetsika famantarana GA miaraka amin'ny sarintanin'ny taham-pitomboan'ny sela (ho solon'ny tanjaky ny fanitarana ny sela ho an'ny sela nomena sy ny selan'ny zanaka vavy amin'ny fizarana) ary miaraka amin'ny sarintanin'ny anisotropy fitomboana, izay mandrefy ny fitarihana ny fanitarana sela (ampiasaina koa eto ho an'ny sela nomena sy ho an'ny sela vavy amin'ny fizarana; Fig. 5a, b, jereo ny fomba sy ny fomba fanampiny). Ny sarintany momba ny taham-pitomboan'ny sela SAM dia mifanaraka amin'ny fandinihana teo aloha38,39, miaraka amin'ny taham-pivoarana kely indrindra eo amin'ny sisin-tany ary ny taham-pivoarana ambony indrindra amin'ny voninkazo (sary 5a). Ny famakafakana singa fototra (PCA) dia naneho fa ny hetsika famantarana GA dia nifanaraka tamin'ny haavon'ny fitomboan'ny sela (sary 5c). Nasehonay ihany koa fa ny famaky lehibe amin'ny fiovaovana, anisan'izany ny fampidirana famantarana GA sy ny haavon'ny fitomboana, dia orthogonal amin'ny tari-dalana voafaritry ny fanehoana CLV3 avo, izay manamarina ny fanilihana ny sela avy amin'ny foibe SAM amin'ny fanadihadiana sisa. Ny famakafakana correlation Spearman dia nanamafy ny valin'ny PCA (sary 5d), izay manondro fa ny mari-pamantarana GA ambony ao amin'ny IPR dia tsy nahatonga ny fitomboan'ny sela avo kokoa. Na izany aza, ny famakafakana ny fifandraisana dia nanambara ny fifandraisana tsara eo amin'ny hetsika famantarana GA sy ny anisotropy fitomboana (sary 5c, d), izay manoro hevitra fa ny mari-pamantarana GA ambony ao amin'ny IPR dia misy fiantraikany amin'ny fitarihana ny fitomboan'ny sela ary mety ny toerana misy ny fiaramanidina fizarana sela.
a, b Sarintanin'ny hafanana amin'ny fitomboan'ny ety ivelany (a) sy ny anisotropy fitomboana (b) ao amin'ny SAM dia salanisa amin'ny zavamaniry tsy miankina fito (ampiasaina ho proxy ho an'ny hery sy ny fitarihana ny fanitarana sela, tsirairay avy). c Ny famakafakana PCA dia ahitana ireto fari-pahalalana manaraka ireto: famantarana GA, ny haavon'ny fitomboan'ny tany, ny anisotropy fitomboan'ny tany, ary ny fanehoana CLV3. Ny singa PCA 1 dia nifanaraka indrindra tamin'ny haavon'ny fitomboan'ny tany ary nifandray tsara tamin'ny famantarana GA. Ny singa PCA 2 dia nifandray tsara indrindra tamin'ny anisotropy fitomboan'ny tany ary nifanaraka tamin'ny fanehoana CLV3. Ny isan-jato dia maneho ny fiovaovana hazavain'ny singa tsirairay. d Ny famakafakana ny fifandraisan'ny Spearman eo amin'ny mari-pamantarana GA, ny haavon'ny fitomboan'ny tany, ary ny anisotropy fitomboan'ny tany amin'ny haavon'ny tavy tsy misy CZ. Ny isa eo ankavanana dia ny sanda Spearman rho eo anelanelan'ny fari-piainana roa. Ny asterisk dia manondro tranga misy ny fifandraisana / fifandraisana ratsy dia tena manan-danja. Sary an-tsary 3D ny sela Col-0 SAM L1 amin'ny mikroskopika confocal. Ny rindrin'ny sela vaovao miforona ao amin'ny SAM (fa tsy ny primordium) amin'ny 10 h dia miloko araka ny sandan'ny zorony. Ny bara loko dia aseho eo amin'ny zorony ambany havanana. Ny sisiny dia mampiseho ny sary 3D mifanaraka amin'izany amin'ny 0 ora. Naverina indroa ny andrana ka nisy vokany mitovy. f Ny sarin'ny boaty dia mampiseho ny tahan'ny fizarazarana sela amin'ny IPR sy tsy IPR Col-0 SAM (n = zavamaniry mahaleo tena 10). Ny tsipika afovoany dia mampiseho ny mediana, ary ny sisin'ny boaty dia manondro ny isan-jato faha-25 sy faha-75. Ny volombava dia manondro ny sanda kely indrindra sy ambony indrindra voafaritry ny rindrambaiko R. Ny sanda P dia azo tamin'ny t-test-t-tailed an'i Welch. g, h Diagram schematic mampiseho (g) ny fomba fandrefesana ny zoro ny rindrin'ny sela vaovao (magenta) amin'ny fanajana ny radial tari-dalana avy amin'ny afovoan'ny SAM (fotsy misy teboka) (acute zoro soatoavina, izany hoe, 0-90 °, no heverina), ary (h) ny circumferential / lateral sy radial tari-dalana ao anatin'ny meristem. i Histograma matetika amin'ny fironan'ny fiaramanidina fizarana sela manerana ny SAM (manga maizina), IPR (manga antonony), ary tsy IPR (manga maivana). Ny sanda P dia azo tamin'ny fitsapana roa-tailed Kolmogorov-Smirnov. Naverina indroa ny andrana ka nisy vokany mitovy. j Ny histograma matetika amin'ny fizotry ny fiaramanidina fizarana sela ny IPR manodidina ny P3 (maitso mazava), P4 (maitso antonony), ary P5 (maitso maizina). Ny sanda P dia azo tamin'ny fitsapana roa-tailed Kolmogorov-Smirnov. Naverina indroa ny andrana ka nisy vokany mitovy.
Noho izany, nanadihady ny fifandraisana misy eo amin'ny famantarana GA sy ny asan'ny fizarana sela izahay amin'ny famantarana ny rindrin'ny sela vao niforona nandritra ny fitsapana (sary 5e). Io fomba fiasa io dia namela anay handrefesana ny matetika sy ny fitarihana ny fizarana sela. Mahagaga fa hitanay fa mitovy ny fatran'ny fizarazaran'ny sela ao amin'ny IPR sy ny sisa amin'ny SAM (tsy IPR, sary 5f), izay manondro fa ny fahasamihafana eo amin'ny famantarana GA eo amin'ny IPR sy ny sela tsy IPR dia tsy misy fiantraikany lehibe amin'ny fizarana sela. Izany, ary ny fifandraisana tsara eo amin'ny mari-pamantarana GA sy ny anisotropy fitomboana, dia nanosika anay handinika raha mety hisy fiantraikany amin'ny fizotry ny fiaramanidina fizarana sela ny hetsika famantarana GA. Norefesintsika ny orientation ny rindrin'ny sela vaovao ho toy ny zoro maranitra mifandray amin'ny axis radial mampifandray ny foibe meristem sy ny afovoan'ny rindrina sela vaovao (sary 5e-i) ary nanamarika ny fironana mazava ho an'ny sela mizara amin'ny zoro manakaiky ny 90 ° raha oharina amin'ny axis radial, miaraka amin'ny frequencies ambony indrindra hita ao amin'ny 70-80 ° (70-80%). (22.62%) (sary 5e, i), mifanaraka amin'ny fizarazarana sela amin'ny circumferential / transverse direction (sary 5h). Mba handinihana ny fandraisan'anjaran'ny mari-pamantarana GA amin'ity fihetsika fizarazarana sela ity, dia nanadihady ny mari-pamantarana fizarana sela ao amin'ny IPR sy tsy IPR misaraka izahay (sary 5i). Hitanay fa ny fizarana zoro fizarana amin'ny sela IPR dia tsy mitovy amin'ny an'ny sela tsy IPR na ao amin'ny sela ao amin'ny SAM manontolo, miaraka amin'ny sela IPR mampiseho ampahany ambony kokoa amin'ny fizarana sela lateral / boribory, izany hoe, 70-80 ° ary 80-90 ° (33.86% ary 30.71%, tsirairay avy, Fig .5). Noho izany, ny fandinihanay dia nanambara ny fifandraisana misy eo amin'ny mari-pamantarana GA avo sy ny fizotry ny fiaramanidina fizarazarana sela akaikin'ny lalana manodidina, mitovy amin'ny fifandraisana misy eo amin'ny hetsika famantarana GA sy anisotropy fitomboana (sary 5c, d). Mba hanamafisana bebe kokoa ny fiarovana ny habakabaka amin'ity fikambanana ity, dia norefesinay ny fizotry ny fiaramanidina fizarana amin'ny sela IPR manodidina ny primordium manomboka amin'ny P3, satria ny hetsika famantarana GA avo indrindra dia hita tao amin'ity faritra ity manomboka amin'ny P4 (sary 4). Ny zoro fizarazaran'ny IPR manodidina ny P3 sy ny P4 dia tsy nahitana fahasamihafana manan-danja ara-statistika, na dia nitombo aza ny fizarazarana sela lateral tao amin'ny IPR manodidina ny P4 (sary 5j). Na izany aza, ao amin'ny sela IPR manodidina ny P5, ny fahasamihafana eo amin'ny orientation ny fiaramanidina fizarana sela dia nanjary manan-danja ara-statistika, miaraka amin'ny fitomboana mafy amin'ny fatran'ny fizarazaran'ny sela transverse (sary 5j). Miaraka, ireo valiny ireo dia manoro hevitra fa ny famantarana GA dia afaka mifehy ny fizotry ny fizarazarana sela ao amin'ny SAM, izay mifanaraka amin'ny tatitra teo aloha40,41 fa ny famantarana GA avo dia mety miteraka orientation lateral amin'ny fizarana sela ao amin'ny IPR.
Voalaza fa ny sela ao amin'ny IPR dia tsy hampidirina ao anaty primordia fa ao anaty internodes2,42,43. Ny fizotry ny fizaran'ny sela ao amin'ny IPR dia mety hiteraka fikambanan'ny andalana lava mitovitovy amin'ny sela epidermis amin'ny internodes. Ny fandinihanay voalaza etsy ambony dia manondro fa ny famantarana GA dia mety manana anjara toerana amin'ity dingana ity amin'ny alàlan'ny fanaraha-maso ny fizaran'ny sela.
Ny fahaverezan'ny fiasan'ny fototarazo DELLA maromaro dia miteraka valiny GA, ary ny della mutants dia azo ampiasaina hitsapana an'io hypothesis io44. Nodinihinay aloha ny fomba fanehoana ny fototarazo DELLA dimy ao amin'ny SAM. Ny fusionan'ny transcriptional an'ny GUS line45 dia nanambara fa ny GAI, RGA, RGL1, ary RGL2 (amin'ny kely kokoa) dia naseho tao amin'ny SAM (sary fanampiny 11a-d). Ny hybridization in situ dia nanaporofo fa ny GAI mRNA dia miangona manokana ao amin'ny primordia sy ny voninkazo mitombo (sary fanampiny 11e). RGL1 sy RGL3 mRNA dia hita manerana ny SAM canopy sy amin'ny voninkazo efa antitra, fa ny RGL2 mRNA dia betsaka kokoa amin'ny faritry ny sisin-tany (Fig. 11f-h fanampiny). Ny sary mihetsika amin'ny pRGL3 :: RGL3-GFP SAM dia nanamafy ny fitenenana voamariky ny hybridization in situ ary nampiseho fa ny proteinina RGL3 dia miangona ao amin'ny faritra afovoan'ny SAM (sary fanampiny 11i). Amin'ny fampiasana ny tsipika pRGA :: GFP-RGA, dia hitanay ihany koa fa miangona ao amin'ny SAM ny proteinina RGA, saingy mihena ny habetsaky ny sisintany manomboka amin'ny P4 (sary fanampiny 11j). Marihina fa ny endrika fanehoana an'ny RGL3 sy RGA dia mifanaraka amin'ny hetsika famantarana GA ambony ao amin'ny IPR, araka ny hitan'ny qmRGA (sary 4). Ankoatr'izay, ireo angon-drakitra ireo dia manondro fa ny DELLA rehetra dia aseho ao amin'ny SAM ary ny fiteniny dia mitambatra amin'ny SAM manontolo.
Nodinihinay avy eo ny mari-pamantarana fizarana sela ao amin'ny SAM (Ler, control) sy ny gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (sary 6a, b). Mahaliana fa nahita fiovana manan-danja ara-statistika izahay tamin'ny fizarana ny haavon'ny zoro fizarana sela ao amin'ny della global mutant SAM raha oharina amin'ny karazana bibidia (sary 6c). Io fiovan'ny della global mutant io dia noho ny fitomboan'ny fatran'ny 80-90 ° zoro (34.71% vs. 24.55%) ary, raha kely indrindra, 70-80 ° zoro (23.78% vs. 20.18%), izany hoe, mifanitsy amin'ny fizarazarana sela transverse (sary 6c). Ny fatran'ny fizarazarana tsy misy transverse (0-60 °) dia ambany ihany koa ao amin'ny della global mutant (sary 6c). Ny fatran'ny fizarazaran'ny sela transverse dia nitombo be tao amin'ny SAM an'ny della global mutant (sary 6b). Ny fatran'ny fizarazarana sela transverse ao amin'ny IPR dia avo kokoa amin'ny della global mutant raha oharina amin'ny karazana bibidia (sary 6d). Eo ivelan'ny faritra IPR, ny karazana bibidia dia nanana fizarana mitovy kokoa amin'ny zoro fizarana sela, fa ny della global mutant dia naleon'ny fizarana tangential toa ny IPR (sary 6e). Nohararaotinay koa ny fizaran'ny fizarazarana sela ao amin'ny SAM an'ny ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ary ga2ox6-2), ga2ox6-2, GA-inactive mutant background izay anangonan'ny GA. Mifanaraka amin'ny fitomboan'ny haavon'ny GA, ny SAM amin'ny quintuple ga2ox mutant inflorescence dia lehibe kokoa noho ny an'ny Col-0 (Supplementary Fig. 12a, b), ary raha ampitahaina amin'ny Col-0, ny quintuple ga2ox SAM dia nampiseho fizarazarana miavaka amin'ny zoro fizarana sela, miaraka amin'ny fatran'ny zoro mitombo avy amin'ny 50 ° mankany amin'ny 90 ° ny fizarazarana indray. 12a–c). Noho izany, asehontsika fa ny fampahavitrihana ny mari-pamantarana GA sy ny fanangonana GA dia miteraka fizarazarana sela lateral ao amin'ny IPR sy ny sisa amin'ny SAM.
a, b sary 3D ny sosona L1 an'ny PI-stained Ler (a) sy global della mutant (b) SAM mampiasa microscopy confocal. Ny rindrin'ny sela vaovao miforona ao amin'ny SAM (fa tsy ny primordium) mandritra ny fe-potoana 10-h dia aseho sy miloko araka ny sandan'ny zorony. Ny fampidirana dia mampiseho ny SAM amin'ny 0 ora. Ny bara loko dia aseho eo amin'ny zorony ambany havanana. Ny zana-tsipìka ao amin'ny (b) dia manondro ohatra iray amin'ny rakitra sela mirindra ao amin'ny della mutant manerantany. Naverina indroa ny andrana ka nisy vokany mitovy. ce fampitahana ny fizarana matetika ny fizarana sela fiaramanidina orientations amin'ny SAM manontolo (d), IPR (e), ary tsy IPR (f) eo amin'ny Ler sy global della. Ny sanda P dia azo tamin'ny fitsapana roa-tailed Kolmogorov-Smirnov. f, g Fijerena sary 3D amin'ny sarin'ny SAM miloko PI an'ny Col-0 (i) sy pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) zavamaniry transgenika. Ny takelaka (a, b) dia mampiseho rindrina sela vaovao (fa tsy primordia) miforona ao amin'ny SAM ao anatin'ny 10 ora. Naverina indroa ny andrana ka nisy vokany mitovy. h–j Fampitahana ny fitsinjarana matetika ny fizotry ny fiaramanidina fizarana sela hita ao amin'ny SAM manontolo (h), IPR (i) ary tsy IPR (j) eo anelanelan'ny Col-0 sy pCUC2 :: gai-1-VENUS zavamaniry. Ny sanda P dia azo tamin'ny alalan'ny fitsapana roa-tailed Kolmogorov-Smirnov.
Nozahanay avy eo ny fiantraikan'ny fanakanana ny famantarana GA manokana ao amin'ny IPR. Ho an'ity tanjona ity dia nampiasa ny mpanentana cotyledon cup 2 (CUC2) izahay mba hanosehana ny fanehoana ny proteinina gai-1 mivadibadika mitambatra amin'ny VENUS (ao amin'ny tsipika pCUC2 :: gai-1-VENUS). Ao amin'ny SAM karazana wild, ny mpanentana CUC2 dia mandrisika ny fanehoana ny ankamaroan'ny IPR ao amin'ny SAM, anisan'izany ny sela sisintany, manomboka amin'ny P4, ary ny fanehoana manokana mitovy amin'izany dia hita ao amin'ny pCUC2 :: gai-1-VENUS (jereo eto ambany). Ny fizarana ny zoro fizarana sela manerana ny SAM na IPR an'ny pCUC2 :: gai-1-VENUS dia tsy mitovy amin'ny an'ny karazana bibidia, na dia tsy nampoizina aza dia hitanay fa ny sela tsy misy IPR ao amin'ireo zavamaniry ireo dia mizara amin'ny haavon'ny 80-90 ° (sary 6f-j).
Misy soso-kevitra fa ny fitarihana ny fizarana sela dia miankina amin'ny géométrie an'ny SAM, indrindra ny adin-tsaina vokatry ny curvature tissue46. Nanontany àry izahay raha niova ny endriky ny SAM tao amin'ny zavamaniry della global mutant sy pCUC2 :: gai-1-VENUS. Araka ny voalaza teo aloha12, ny haben'ny della global mutant SAM dia lehibe kokoa noho ny an'ny karazana bibidia (Fig. 13a, b, d). Ny hybridization in situ an'ny CLV3 sy STM RNA dia nanamafy ny fanitarana ny meristem amin'ny della mutants ary nampiseho bebe kokoa ny fanitarana lateral ny niche cellule stem (sary fanampiny 13e, f, h, i). Na izany aza, ny curvature SAM dia nitovitovy tamin'ny genotypes roa (Fig. 13k fanampiny, m, n, p). Hitanay ny fitomboana mitovy amin'ny haben'ny gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant tsy misy fiovana amin'ny curvature raha oharina amin'ny karazana bibidia (Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Ny fatran'ny fizarazaran'ny sela ihany koa dia nisy fiantraikany tamin'ny della quadruple mutant, saingy kely kokoa noho ny della monolithic mutant (fanampiny sary 12d-f). Ity vokatry ny dosage ity, miaraka amin'ny tsy fahampian'ny fiantraikany amin'ny curvature, dia manoro hevitra fa ny hetsika RGL3 sisa tavela ao amin'ny Della quadruple mutant dia mametra ny fiovan'ny fizaran'ny sela vokatry ny fahaverezan'ny hetsika DELLA ary ny fiovan'ny fizarana sela lateral dia mitranga ho setrin'ny fiovan'ny hetsika famantarana GA fa tsy ny fiovan'ny geometry SAM. Araka ny voalaza etsy ambony, ny mpanentana CUC2 dia mitondra ny fanehoana IPR ao amin'ny SAM manomboka amin'ny P4 (sary fanampiny 14a, b), ary mifanohitra amin'izany, ny pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM dia nihena ny habeny fa ny curvature ambony kokoa (Fig. 14c-h fanampiny). Ity fiovan'ny pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morphology ity dia mety hiteraka fizarazarana hafa amin'ny adin-tsaina ara-mekanika raha oharina amin'ny karazana bibidia, izay manomboka amin'ny halavirana kely kokoa avy amin'ny foibe SAM47 ny adin-tsaina ambony. Raha tsy izany, ny fiovan'ny pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morphology dia mety vokatry ny fiovan'ny toetra mekanika isam-paritra vokatry ny transgene expression48. Amin'ireo tranga roa ireo, dia mety hanonitra ny vokatry ny fiovan'ny mari-pamantarana GA izany amin'ny fampitomboana ny mety hisian'ny fizarana sela amin'ny orientation circumferential / transverse, manazava ny fandinihanay.
Raha atambatra, ny angon-drakitray dia manamafy fa ny mari-pamantarana GA avo kokoa dia mitana anjara toerana mavitrika amin'ny orientation lateral ny fiaramanidina fizarana sela ao amin'ny IPR. Asehon'izy ireo ihany koa fa ny curvature meristem dia misy fiantraikany amin'ny fizotry ny fiaramanidina fizarana sela ao amin'ny IPR.
Ny orientation transverse amin'ny fiaramanidina fizarana ao amin'ny IPR, noho ny hetsika famantarana GA avo, dia manoro hevitra fa ny GA dia mandamina mialoha ny rakitra sela radial ao amin'ny epidermis ao anatin'ny SAM mba hamaritana ny fikambanana sela izay ho hita ao amin'ny internode epidermis. Eny tokoa, hita matetika amin'ny sary SAM an'ny della global mutants ny rakitra sela toy izany (sary 6b). Noho izany, mba hijerena bebe kokoa ny fiasan'ny fivoaran'ny lamina ara-potoanan'ny famantarana GA ao amin'ny SAM, dia nampiasa sary an-tsarimihetsika izahay mba handinihana ny fandaminana ny sela ao amin'ny IPR amin'ny karazana bibidia (Ler sy Col-0), della global mutants, ary pCUC2 :: gai-1-VENUS zavamaniry transgenika.
Hitanay fa ny qmRGA dia naneho fa ny hetsika famantarana GA ao amin'ny IPR dia nitombo avy amin'ny P1 / P2 ary nipoitra tao amin'ny P4, ary io lamina io dia nijanona tsy tapaka tamin'ny fotoana (sary 4a-f sy Fig. 8c-f, k). Ho famakafakana ny fandaminana spatial ny sela ao amin'ny IPR miaraka amin'ny fitomboan'ny GA mari-pamantarana, dia nasianay marika ny Ler IPR sela etsy ambony sy ny sisin'ny P4 araka ny fivoaran'izy ireo nodinihina 34 h taorian'ny fandinihana voalohany, izany hoe, mihoatra ny roa plastid fotoana, mamela antsika hanaraka ny sela IPR nandritra ny fampandrosoana ny primordium avy amin'ny P1 / P2 ho P4. Nampiasa loko telo samihafa izahay: mavo ho an'ireo sela izay tafiditra ao amin'ny primordium akaikin'ny P4, maitso ho an'ireo izay ao amin'ny IPR, ary volomparasy ho an'ireo izay nandray anjara tamin'ny dingana roa (sary 7a-c). Ao amin'ny t0 (0 h), ny sela 1-2 amin'ny sela IPR dia hita eo anoloan'ny P4 (sary 7a). Araka ny efa nampoizina, rehefa nizara ireo sela ireo, dia tamin'ny alalan'ny fiaramanidina fizarazarana transverse (sary 7a–c). Ny vokatra mitovy amin'izany dia azo tamin'ny fampiasana Col-0 SAM (mifantoka amin'ny P3, izay miforitra mitovy amin'ny P4 ao amin'ny Ler ny sisin-tany), na dia ao anatin'io genotype io aza ny vala miforona eo amin'ny sisin'ny voninkazo dia nanafina haingana kokoa ny sela IPR (sary 7g–i). Noho izany, ny lamin'ny fizarana ny sela IPR dia mandamina mialoha ny sela ho andalana radial, toy ny amin'ny internodes. Ny fandaminana ny tsipika radial sy ny fametrahana ny sela IPR eo anelanelan'ny taova nifandimby dia manondro fa ireo sela ireo dia progenitors internodal.
Eto izahay dia namolavola biosensor famantarana GA ratiometric, qmRGA, izay mamela ny fametahana sariitatra ny hetsika famantarana GA vokatry ny fifantohana GA sy GA miaraka amin'ny fampihenana ny fanelingelenana amin'ny lalan'ny famantarana endogenous, ka manome fampahalalana momba ny fiasan'ny GA amin'ny ambaratonga sela. Ho an'ity tanjona ity, dia nanamboatra proteinina DELLA novaina izahay, mRGA, izay tsy afaka mamatotra ny mpiara-miombon'antoka amin'ny DELLA saingy mijanona ho saro-pady amin'ny proteolysis ateraky ny GA. Ny qmRGA dia mamaly ny fiovan'ny exogenous sy endogenous amin'ny haavon'ny GA, ary ny fananany dynamic sensing dia mamela ny fanombanana ny fiovan'ny spatiotemporal amin'ny hetsika famantarana GA mandritra ny fampandrosoana. qmRGA koa dia fitaovana tena mora azo satria azo ampifanarahana amin'ny tavy isan-karazany amin'ny alàlan'ny fanovana ny mpanentana ampiasaina amin'ny fanehoana azy (raha ilaina), ary noho ny toetra voatahiry amin'ny lalana famantarana GA sy ny motif PFYRE manerana ny angiosperms, dia azo inoana fa azo afindra amin'ny karazana hafa22. Mifanaraka amin'izany, ny mutation mitovy amin'ny proteinina SLR1 DELLA vary (HYY497AAA) dia naseho ihany koa fa manafoana ny hetsika famoretana ny fitomboan'ny SLR1 raha toa ka mampihena kely ny fahapotehan'ny GA-mediated azy, mitovy amin'ny mRGA23. Marihina fa ny fanadihadiana vao haingana tao amin'ny Arabidopsis dia naneho fa ny fiovan'ny asidra amino tokana ao amin'ny sehatra PFYRE (S474L) dia nanova ny asan'ny transcriptional an'ny RGA nefa tsy misy fiantraikany amin'ny fahafahany mifandray amin'ny mpiara-miombon'antoka transcription50. Na dia eo akaikin'ny fanoloana asidra amine 3 misy ao amin'ny mRGA aza ity mutation ity, ny fandinihanay dia mampiseho fa ireo fiovana roa ireo dia manova ny toetra mampiavaka ny DELLA. Na dia mifamatotra amin'ny sehatra LHR1 sy SAW an'ny DELLA26,51 aza ny ankamaroan'ny mpiara-miombon'antoka transcription, dia mety hanampy amin'ny fanamafisana ireo fifandraisana ireo ny asidra amine voatahiry ao amin'ny sehatra PFYRE.
Ny fampandrosoana ny internode dia toetra manan-danja amin'ny rafitry ny zavamaniry sy ny fanatsarana ny vokatra. qmRGA dia nanambara hetsika famantarana GA ambony kokoa amin'ny sela progenitor internode IPR. Amin'ny fampifangaroana ny sary sy ny génétique quantitative, dia nasehonay fa ny lamina famantarana GA dia mametraka ny planina fizarana sela / transverse amin'ny epidermis SAM, mamolavola ny fikambanan'ny fizarana sela ilaina amin'ny fampandrosoana internode. Mpandrindra maromaro momba ny fizotry ny fiaramanidina fizarana sela no fantatra nandritra ny fampandrosoana52,53. Ny asantsika dia manome ohatra mazava momba ny fomba fitondran'ny hetsika famantarana GA amin'ity mari-pamantarana finday ity. DELLA dia afaka mifandray amin'ny prefolding proteinina complexes41, ka GA signaling dia mety hifehy ny fizarazarana sela fiaramanidina orientation amin'ny alalan'ny fiantraikany mivantana cortical microtubule orientation40,41,54,55. Nasehon'ny tsy nampoizina fa ao amin'ny SAM, ny fifandraisana amin'ny hetsika famantarana GA avo kokoa dia tsy ny fanitarana ny sela na ny fizarana, fa ny anisotropy fitomboana ihany, izay mifanaraka amin'ny fiantraikany mivantana amin'ny GA amin'ny fitarihana ny fizarana sela ao amin'ny IPR. Na izany aza, tsy azontsika atao ny manilika fa mety ho ankolaka ihany koa io vokatra io, ohatra amin'ny alàlan'ny fanalefahana ny rindrina sela GA-induced56. Ny fiovan'ny toetran'ny rindrin'ny sela dia miteraka adin-tsaina mekanika57,58, izay mety hisy fiantraikany amin'ny fizotry ny fiaramanidina fizarazarana sela amin'ny alàlan'ny fiatraikany amin'ny orientation ny microtubules cortical39,46,59. Ny voka-dratsin'ny adin-tsaina mekanika vokatry ny GA sy ny fanaraha-maso mivantana ny orientation microtubule amin'ny GA dia mety ho tafiditra amin'ny famoronana lamina manokana momba ny fizarazarana sela ao amin'ny IPR mba hamaritana ny internodes, ary ilaina ny fandalinana fanampiny mba hitsapana io hevitra io. Toy izany koa, ny fanadihadiana teo aloha dia nanasongadina ny maha-zava-dehibe ny proteinina DELLA-interacting TCP14 sy 15 amin'ny fanaraha-maso ny fananganana internode60,61 ary ireo anton-javatra ireo dia mety hanelanelana ny hetsika GA miaraka amin'ny BREVIPEDICELLUS (BP) sy PENNYWISE (PNY), izay mifehy ny fivoaran'ny internode ary hita fa misy fiantraikany amin'ny signaling GA2,62. Raha jerena fa ny DELLA dia mifandray amin'ny brassinosteroid, ethylene, asidra jasmonic, ary asidra abscisic (ABA) famantarana ny lalana63,64 ary ireo hormones ireo dia mety hisy fiantraikany amin'ny microtubule orientation65, ny fiantraikan'ny GA amin'ny fizarazaran'ny sela dia mety ho mpanelanelana amin'ny hormones hafa.
Ny fandinihana cytological tany am-boalohany dia naneho fa ny faritra anatiny sy ivelany amin'ny Arabidopsis SAM dia ilaina amin'ny fivoaran'ny internode2,42. Ny zava-misy fa ny GA dia mandrindra ny fizarazaran'ny sela ao amin'ny tissues anatiny12 dia manohana ny asa roa an'ny GA amin'ny fifehezana ny meristem sy ny haben'ny internode ao amin'ny SAM. Ny lamin'ny fizarazaran'ny sela tari-dalana dia voafehy tsara ihany koa ao amin'ny tavy SAM anatiny, ary io fitsipika io dia tena ilaina amin'ny fitomboan'ny taho52. Mahaliana ny mandinika raha toa ka mandray anjara amin'ny orientation ny fiaramanidina fizarana sela ao amin'ny fikambanana SAM anatiny ny GA, ka mampifanaraka ny famaritana sy ny fampandrosoana ny internodes ao anatin'ny SAM.
Ny zavamaniry dia nambolena in vitro tao anaty tany na 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) nampiana 1% sucrose sy 1% agar (Sigma) eo ambanin'ny fepetra mahazatra (16 h hazavana, 22 ° C), afa-tsy ny hypocotyl sy ny fanandramana fitomboan'ny faka izay nambolena zana-kazo tamin'ny takelaka mitsangana eo ambanin'ny hazavana tsy tapaka ary 22 ° C. Ho an'ny fanandramana nitrate, ny zavamaniry dia nambolena tamin'ny medium MS novaina (bioWORLD plant medium) nampian'ny nitrate sahaza (0 na 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinate, 1% sucrose ary 1% A-agar (Sigma) mandritra ny andro maharitra.
Ny GID1a cDNA nampidirina tao amin'ny pDONR221 dia natambatra indray tamin'ny pDONR P4-P1R-pUBQ10 ary pDONR P2R-P3-mCherry tao amin'ny pB7m34GW mba hamoronana pUBQ10 :: GID1a-mCherry. Ny ADN IDD2 nampidirina tao amin'ny pDONR221 dia natambatra ho pB7RWG266 mba hamoronana p35S: IDD2-RFP. Mba hamoronana pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b, sombintsombiny 3.9 kb ambony amin'ny faritry ny kaody GID1b ary sombiny 4.7 kb misy ny GID1b cDNA (1.3 kb) sy terminator (3.4 kb) dia nohamafisina voalohany tamin'ny fampiasana ny primers ao amin'ny PR1Prmo fanampiny ao amin'ny PR-P1 avy eo. Fisher Scientific) ary pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), ary farany dia natambatra indray tamin'ny pDONR221 2xmTQ268 ho ao amin'ny vector kendrena pGreen 012567 mampiasa ny kloning Gateway. Mba hamoronana pCUC2 :: LSSmOrange, ny filaharan'ny mpanentana CUC2 (3229 bp ambony amin'ny ATG) arahin'ny filaharan'ny coding an'ny Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange) 69 lehibe miaraka amin'ny mari-pamantarana localization nokleary N7 ary ny NOS transcriptional terminator dia nivory tao amin'ny pGreen fragment kanmycin vectoriel . (Invitrogen). Nampidirina tao amin'ny Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 ny vector binary zavamaniry ary nampidirina tao amin'ny ravina Nicotiana benthamiana tamin'ny alàlan'ny fomba fampidirana Agrobacterium ary tao amin'ny Arabidopsis thaliana Col-0 tamin'ny fomba dip voninkazo. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry sy pCLV3::mCherry-NLS qmRGA dia notokanana avy amin'ny F3 sy F1 avy amin'ny lakroa tsirairay avy.
Ny RNA in situ hybridization dia natao teo amin'ny 1 sm teo ho eo ny tifitra tip72, izay nangonina ary avy hatrany dia napetraka tao amin'ny vahaolana FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) nafanaina mialoha hatramin'ny 4 ° C. Taorian'ny fitsaboana vacuum 2 × 15 min, dia niova ny fixative ary natsipy nandritra ny alina ny santionany. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, ary RGL3 cDNAs ary antisense probes amin'ny 3′-UTRs dia novolavolaina tamin'ny fampiasana ireo primer aseho ao amin'ny tabilao fanampiny 3 araka ny nofaritan'i Rosier et al.73. Ny probe misy marika digoxigenin dia tsy voamarina amin'ny fampiasana antikôla digoxigenin (3000-fold dilution; Roche, laharan'ny katalaogy: 11 093 274 910), ary ny fizarana dia nolokoana tamin'ny 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-foldly tetrafold N/BT) dilution) vahaolana.
Fotoana fandefasana: Feb-10-2025