Tena ilaina amin'ny fananganana ny tahony ny fitomboan'ny meristem apical (SAM). Hormonina avy amin'ny zavamanirygiberelinina(GA) dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny fandrindrana ny fitomboan'ny zavamaniry, saingy mbola tsy dia mazava loatra ny anjara asany ao amin'ny SAM. Eto izahay dia namorona biosensor ratiometric an'ny famantarana GA tamin'ny alàlan'ny injeniera ny proteinina DELLA mba hampihenana ny asany ara-dalàna amin'ny valinteny transcription GA sady miaro ny fahasimbany rehefa fantatra ny GA. Asehonay fa ity biosensor mifototra amin'ny fahasimbana ity dia mirakitra tsara ny fiovana eo amin'ny haavon'ny GA sy ny fahatsapana sela mandritra ny fivoarana. Nampiasa ity biosensor ity izahay mba handrafetana ny asan'ny famantarana GA ao amin'ny SAM. Asehonay fa ny famantarana GA avo dia hita indrindra amin'ny sela eo anelanelan'ny primordia organ, izay mialoha ny sela internode. Amin'ny fampiasana fomba fiasa tombony sy fatiantoka, dia asehonay bebe kokoa fa ny GA dia mifehy ny fironan'ny fiaramanidina fizarana sela, mametraka ny fandaminana sela kanonika amin'ny internodes, ka mampiroborobo ny famaritana internode ao amin'ny SAM.
Ny meristem apical shoot (SAM), izay hita eo amin'ny tendron'ny tsimoka, dia misy toerana kely misy sela fototra izay mamokatra taova lateral sy node shoot amin'ny fomba modular sy iterative mandritra ny androm-piainan'ny zavamaniry. Ny tsirairay amin'ireo singa miverimberina ireo, na node plant, dia ahitana internodes sy organ lateral eo amin'ny nodes, ary meristem axillary ao amin'ny axils ravina1. Miova ny fitomboana sy ny fandaminana ny node plant mandritra ny fivoarana. Ao amin'ny Arabidopsis, dia voasakana ny fitomboana internodal mandritra ny dingana vegetative, ary mijanona ho matory ao amin'ny axils ravina rosette ny meristem axillary. Mandritra ny fifindrana mankany amin'ny dingana voninkazo, ny SAM dia lasa meristem inflorescence, ka miteraka internodes lava sy tsimoka axillary, sampana kely ao amin'ny axils ravina cauline, ary taty aoriana, voninkazo tsy misy ravina2. Na dia efa nandroso be aza isika teo amin'ny fahatakarana ny mekanisma mifehy ny fiandohan'ny ravina, voninkazo ary sampana, dia mbola kely ny fantatra momba ny fomba ipoiran'ny internodes.
Ny fahatakarana ny fizarana ara-potoana sy ara-toerana ny GA dia hanampy amin'ny fahatakarana tsara kokoa ny asan'ireo hormonina ireo amin'ny sela samihafa sy amin'ny dingana samihafa amin'ny fivoarana. Ny fijerena ny fahasimban'ny fifangaroan'ny RGA-GFP izay aseho eo ambanin'ny fihetsiky ny mpandrindra azy manokana dia manome fampahalalana manan-danja momba ny fandrindrana ny haavon'ny GA manontolo ao amin'ny fakany15,16. Na izany aza, miovaova arakaraka ny sela ny fanehoana RGA17 ary fehezin'ny GA18. Noho izany, ny fanehoana samihafa ny mpandrindra RGA dia mety hiteraka lamina fluorescence hita amin'ny RGA-GFP ary noho izany dia tsy azo vinavinaina ity fomba ity. Vao haingana, ny bioactive fluorescein (Fl)-labeled GA19,20 dia naneho ny fiangonan'ny GA ao amin'ny endocortex fakany sy ny fandrindrana ny haavon'ny selany amin'ny alàlan'ny fitaterana GA. Vao haingana, ny sensor GA FRET nlsGPS1 dia naneho fa ny haavon'ny GA dia mifandray amin'ny fanitarana ny sela ao amin'ny fakany, kofehy, ary hypocotyls maizina21. Na izany aza, araka ny efa hitantsika, ny fifantohana GA dia tsy ny hany parameter mifehy ny asan'ny famantarana GA, satria miankina amin'ny dingana sarotra amin'ny fahatsapana izany. Eto, mifototra amin'ny fahatakarantsika ny lalan'ny famantarana DELLA sy GA, dia mitatitra ny fivoarana sy ny famaritana ny biosensor ratiometric mifototra amin'ny fahasimbana ho an'ny famantarana GA izahay. Mba hampivoarana ity biosensor quantitative ity, dia nampiasa RGA mutant saro-pady GA izahay izay natambatra tamin'ny proteinina fluorescent ary naseho miely patrana tao amin'ny sela, ary koa proteinina fluorescent tsy saro-pady GA. Asehonay fa ny fifangaroan'ny proteinina RGA mutant dia tsy manelingelina ny famantarana GA endogenous rehefa aseho miely patrana, ary ity biosensor ity dia afaka mandrefy ny asan'ny famantarana vokatry ny fidirana GA sy ny fanodinana famantarana GA ataon'ny fitaovana sensor miaraka amin'ny resolution spatiotemporal avo lenta. Nampiasa ity biosensor ity izahay mba hanoritsiana ny fizarana spatiotemporal amin'ny asan'ny famantarana GA ary handrefesana ny fomba fandrindran'ny GA ny fitondran-tenan'ny sela ao amin'ny epidermis SAM. Asehonay fa ny GA dia mandrindra ny fironan'ny sehatra fizarazarana amin'ny sela SAM izay eo anelanelan'ny primordia organ, ka mamaritra ny fandaminana sela kanônika amin'ny internode.
Farany, nanontany izahay raha afaka mitatitra ny fiovan'ny haavon'ny GA endogenous amin'ny alàlan'ny hypocotyls mitombo ny qmRGA. Nasehonay teo aloha fa ny nitrate dia mandrisika ny fitomboana amin'ny alàlan'ny fampitomboana ny fananganana GA ary, vokatr'izany, ny fahasimban'ny DELLA34. Araka izany, dia hitanay fa ny halavan'ny hypocotyl ao amin'ny zana-kazo pUBQ10::qmRGA ambolena amin'ny famatsiana nitrate be dia be (10 mM NO3−) dia lava kokoa noho ny an'ny zana-kazo ambolena amin'ny toe-javatra tsy ampy nitrate (Sary Fanampiny 6a). Mifanaraka amin'ny fihetsiky ny fitomboana, ny famantarana GA dia avo kokoa amin'ny hypocotyls amin'ny zana-kazo ambolena amin'ny toe-javatra 10 mM NO3− noho ny amin'ny zana-kazo ambolena amin'ny tsy fisian'ny nitrate (Sary Fanampiny 6b, c). Noho izany, ny qmRGA koa dia ahafahana manara-maso ny fiovan'ny famantarana GA vokatry ny fiovana endogenous amin'ny fifantohana GA.
Mba hahatakarana raha miankina amin'ny fifantohana GA sy ny fahatsapana GA ny asan'ny famantarana GA hitan'ny qmRGA, araka ny nantenaina mifototra amin'ny endriky ny sensor, dia nodinihinay ny fanehoan'ireo mpandray GID1 telo ao amin'ny sela zavamaniry sy fananahana. Tamin'ny zana-kazo, ny tsipika mpanao tatitra GID1-GUS dia naneho fa ny GID1a sy c dia naneho betsaka tao amin'ny cotyledons (Sary 3a–c). Ho fanampin'izany, ireo mpandray telo ireo dia naneho tao amin'ny ravina, ny primordia fakany lateral, ny tendron'ny faka (ankoatra ny satroka faka amin'ny GID1b), ary ny rafitra vaskular (Sary 3a–c). Tao amin'ny SAM inflorescence, dia nahita famantarana GUS ho an'ny GID1b sy 1c ihany izahay (Sary Fanampiny 7a–c). Ny hybridization in situ dia nanamafy ireo lamina fanehoana ireo ary naneho bebe kokoa fa ny GID1c dia naneho mitovy amin'ny ambaratonga ambany ao amin'ny SAM, raha toa kosa ny GID1b dia naneho fanehoana ambony kokoa teo amin'ny sisin'ny SAM (Sary Fanampiny 7d–l). Ny fampifangaroana ny pGID1b::2xmTQ2-GID1b dia naneho ihany koa ny fisian'ny fanehoana GID1b amin'ny ambaratonga samihafa, manomboka amin'ny fanehoana ambany na tsy misy mihitsy eo afovoan'ny SAM ka hatramin'ny fanehoana avo lenta eo amin'ny sisin'ny taova (Sary Fanampiny 7m). Noho izany, ny mpandray GID1 dia tsy miparitaka mitovy manerana sy ao anatin'ny sela. Tamin'ny andrana nanaraka, dia hitanay ihany koa fa ny fanehoana tafahoatra ny GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) dia nampitombo ny fahatsapan'ny qmRGA ao amin'ny hypocotyls amin'ny fampiharana GA ivelany (Sary 3d, e). Mifanohitra amin'izany, ny fluorescence refesina amin'ny qd17mRGA ao amin'ny hypocotyl dia tsy mora voan'ny fitsaboana GA3 (Sary 3f, g). Ho an'ny fanadihadiana roa tonta, ny zana-ketsa dia notsaboina tamin'ny fifantohana avo lenta amin'ny GA (100 μM GA3) mba hanombanana ny fihetsiky ny sensor haingana, izay nitombo na very ny fahafahana mifamatotra amin'ny mpandray GID1. Ireo valiny ireo miaraka dia manamafy fa ny biosensor qmRGA dia miasa miaraka amin'ny maha-capteur GA sy GA azy, ary manondro fa ny fanehoana samihafa ny receptor GID1 dia afaka manova be ny emissivity an'ny sensor.
Hatramin'izao, mbola tsy mazava ny fizarazarana ny famantarana GA ao amin'ny SAM. Noho izany, nampiasa zavamaniry maneho qmRGA sy ny mpanao tatitra sela fototra pCLV3::mCherry-NLS izahay35 mba hikajiana sarintany quantitative avo lenta momba ny asan'ny famantarana GA, mifantoka amin'ny sosona L1 (epidermis; Sary 4a, b, jereo ny Fomba sy Fomba Fanampiny), satria ny L1 dia mitana anjara toerana lehibe amin'ny fanaraha-maso ny fitomboan'ny SAM36. Eto, ny fanehoana pCLV3::mCherry-NLS dia nanome teboka fanondroana geometrika raikitra ho an'ny famakafakana ny fizarazarana ara-potoana ny asan'ny famantarana GA37. Na dia heverina ho tena ilaina amin'ny fivoaran'ny taova lateral aza ny GA4, dia hitanay fa ambany ny famantarana GA ao amin'ny primordium voninkazo (P) manomboka amin'ny dingana P3 (Sary 4a, b), raha toa kosa ny primordium P1 sy P2 tanora dia manana asa antonony mitovy amin'ny any amin'ny faritra afovoany (Sary 4a, b). Hita teo amin'ny sisin'ny primordium-n'ny taova ny fiasan'ny famantarana GA ambony kokoa, nanomboka teo amin'ny P1/P2 (teo amin'ny sisin'ny sisin-tany) ary nahatratra ny fara tampony teo amin'ny P4, ary koa tao amin'ny sela rehetra teo amin'ny faritra periferika teo anelanelan'ny primordia (Sary 4a, b ary Sary Fanampiny 8a, b). Tsy hita teo amin'ny epidermis ihany io fiasan'ny famantarana GA ambony io fa teo amin'ny sosona L2 sy ambony L3 koa (Sary Fanampiny 8b). Tsy niova ihany koa ny lamina famantarana GA hita tao amin'ny SAM tamin'ny fampiasana qmRGA rehefa nandeha ny fotoana (Sary Fanampiny 8c–f, k). Na dia nihena tsikelikely aza ny fananganana qd17mRGA tao amin'ny SAM an'ny zavamaniry T3 avy amin'ny tsipika tsy miankina dimy izay nohazavainay tamin'ny antsipiriany, dia afaka nandinika ny lamina fluorescence azo tamin'ny fananganana pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP izahay (Sary Fanampiny 8g–j, l). Tao amin'ity tsipika fanaraha-maso ity, fiovana kely fotsiny teo amin'ny tahan'ny fluorescence no hita tao amin'ny SAM, saingy tao amin'ny foiben'ny SAM dia nahita fihenan'ny VENUS mazava sy tsy nampoizina mifandraika amin'ny TagBFP izahay. Izany dia manamafy fa ny lamina famantarana hitan'ny qmRGA dia maneho ny fahasimban'ny mRGA-VENUS miankina amin'ny GA, saingy mampiseho ihany koa fa ny qmRGA dia mety hanombana tafahoatra ny asan'ny famantarana GA ao amin'ny foibe meristem. Raha fintinina, ny valin'ny fikarohanay dia mampiseho lamina famantarana GA izay maneho voalohany indrindra ny fizarana ny primordia. Io fizarana ny faritra inter-primordial (IPR) io dia vokatry ny fananganana tsikelikely ny asan'ny famantarana GA avo lenta eo amin'ny primordium mivoatra sy ny faritra afovoany, raha miaraka amin'izay koa dia mihena ny asan'ny famantarana GA ao amin'ny primordium (Sary 4c, d).
Ny fizarazarana ny mpandray GID1b sy GID1c (jereo etsy ambony) dia manondro fa ny fanehoana samihafa ny mpandray GA dia manampy amin'ny famolavolana ny lamina fiasan'ny famantarana GA ao amin'ny SAM. Nanontany tena izahay raha mety ho tafiditra amin'izany ny fiangonan'ny GA samihafa. Mba handinihana izany mety hitranga izany, dia nampiasa ny sensor nlsGPS1 GA FRET izahay21. Hita tao amin'ny SAM an'ny nlsGPS1 notsaboina tamin'ny 10 μM GA4+7 nandritra ny 100 minitra ny fitomboan'ny fatran'ny fampahavitrihana (Sary Fanampiny 9a–e), izay manondro fa mamaly ny fiovan'ny fifantohana GA ao amin'ny SAM ny nlsGPS1, toy ny ataony amin'ny fakany21. Ny fizarazarana ara-toerana ny fatran'ny fampahavitrihana nlsGPS1 dia naneho ny haavon'ny GA ambany dia ambany tao amin'ny sosona ivelany amin'ny SAM, saingy nampiseho fa avo lenta eo afovoany sy eo amin'ny sisin'ny SAM izy ireo (Sary 4e sy Sary Fanampiny 9a,c). Izany dia manondro fa ny GA dia zaraina ao amin'ny SAM ihany koa miaraka amin'ny lamina ara-toerana azo ampitahaina amin'ny asehon'ny qmRGA. Ho toy ny fomba fiasa mifameno, dia notsaboinay tamin'ny GA fluorescent (GA3-, GA4-, GA7-Fl) na Fl irery ihany koa ny SAM ho toy ny fanaraha-maso ratsy. Niely nanerana ny SAM ny famantarana Fl, anisan'izany ny faritra afovoany sy ny primordium, na dia tamin'ny hamafiny ambany kokoa aza (Sary 4j sy Sary Fanampiny 10d). Mifanohitra amin'izany kosa, ireo GA-Fl telo ireo dia niangona manokana tao anatin'ny sisin'ny primordium ary tamin'ny ambaratonga samihafa tao amin'ny ambin'ny IPR, miaraka amin'ny GA7-Fl miangona ao amin'ny sehatra lehibe indrindra ao amin'ny IPR (Sary 4k sy Sary Fanampiny 10a,b). Ny fandrefesana ny hamafin'ny fluorescence dia naneho fa ny tahan'ny hamafin'ny IPR amin'ny tsy IPR dia ambony kokoa ao amin'ny SAM notsaboina GA-Fl raha oharina amin'ny SAM notsaboina Fl (Sary 4l sy Sary Fanampiny 10c). Ireo valiny ireo dia manambara fa ny GA dia misy amin'ny fifantohana ambony kokoa ao amin'ny sela IPR izay akaiky indrindra ny sisin'ny taova. Izany dia manambara fa ny lamina amin'ny asan'ny famantarana SAM GA dia vokatry ny fanehoana samihafa ny mpandray GA sy ny fiangonan'ny GA samihafa ao amin'ny sela IPR akaikin'ny sisin'ny taova. Noho izany, ny fanadihadianay dia naneho lamina spatio-temporal tsy nampoizina amin'ny famantarana GA, miaraka amin'ny hetsika ambany kokoa ao afovoany sy primordium an'ny SAM ary hetsika ambony kokoa ao amin'ny IPR ao amin'ny faritra periferika.
Mba hahatakarana ny anjara asan'ny fiasan'ny famantarana GA samihafa ao amin'ny SAM, dia nodinihinay ny fifandraisana misy eo amin'ny fiasan'ny famantarana GA, ny fivelaran'ny sela, ary ny fizarazaran'ny sela tamin'ny fampiasana sary mivantana avy amin'ny SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Noho ny anjara asan'ny GA amin'ny fandrindrana ny fitomboana, dia nantenaina ny fifandraisana tsara amin'ny masontsivana fivelaran'ny sela. Noho izany, dia nampitahainay aloha ny sarintany fiasan'ny famantarana GA tamin'ny sarintany momba ny tahan'ny fitomboan'ny velaran'ny sela (ho toy ny solontenan'ny tanjaky ny fivelaran'ny sela ho an'ny sela iray sy ho an'ny sela zanakavavy amin'ny fizarazarana) ary tamin'ny sarintany anisotropy fitomboana, izay mandrefy ny fitarihan'ny fivelaran'ny sela (ampiasaina eto ihany koa ho an'ny sela iray sy ho an'ny sela zanakavavy amin'ny fizarazarana; Sary 5a,b, jereo ny Fomba sy Fomba Fanampiny). Ny sarintanyy momba ny tahan'ny fitomboan'ny velaran'ny sela SAM dia mifanaraka amin'ny fandinihana teo aloha38,39, miaraka amin'ny tahan'ny fitomboana kely indrindra eo amin'ny sisin-tany ary ny tahan'ny fitomboana ambony indrindra amin'ny voninkazo mivoatra (Sary 5a). Ny fanadihadiana singa fototra (PCA) dia naneho fa ny fiasan'ny famantarana GA dia mifandray ratsy amin'ny hamafin'ny fitomboan'ny velaran'ny sela (Sary 5c). Nasehonay ihany koa fa ireo axe lehibe amin'ny fiovaovana, anisan'izany ny fidirana famantarana GA sy ny hamafin'ny fitomboana, dia orthogonal amin'ny lalana voafaritry ny fanehoana CLV3 avo lenta, izay manamafy ny fanilihana ny sela amin'ny foibe SAM amin'ny fanadihadiana sisa. Ny fanadihadiana momba ny fifandraisan'i Spearman dia nanamafy ny valin'ny PCA (Sary 5d), izay manondro fa ny famantarana GA ambony kokoa ao amin'ny IPR dia tsy miteraka fanitarana sela ambony kokoa. Na izany aza, ny fanadihadiana momba ny fifandraisana dia naneho fifandraisana tsara kely teo amin'ny asan'ny famantarana GA sy ny anisotropy fitomboana (Sary 5c, d), izay manondro fa ny famantarana GA ambony kokoa ao amin'ny IPR dia misy fiantraikany amin'ny lalana fitomboan'ny sela ary mety ho ny toerana misy ny sehatra fizarana sela.
a, b Sarintany hafanana maneho ny fitomboan'ny ety ambonin'ny tany antonony (a) sy ny anisotropia fitomboana (b) ao amin'ny SAM natao salan'isa tamin'ny zavamaniry tsy miankina fito (ampiasaina ho solon'ny tanjaka sy ny fitarihan'ny fanitarana sela). c Ny fanadihadiana PCA dia nahitana ireto fiovaovana manaraka ireto: famantarana GA, ny hamafin'ny fitomboan'ny ety ambonin'ny tany, ny anisotropia fitomboan'ny ety ambonin'ny tany, ary ny fanehoana CLV3. Ny singa PCA 1 dia mifandray ratsy indrindra amin'ny hamafin'ny fitomboan'ny ety ambonin'ny tany ary mifandray tsara amin'ny famantarana GA. Ny singa PCA 2 dia mifandray tsara indrindra amin'ny anisotropia fitomboan'ny ety ambonin'ny tany ary mifandray ratsy amin'ny fanehoana CLV3. Ny isan-jato dia maneho ny fiovaovana hazavain'ny singa tsirairay. d Famakafakana ny fifandraisan'ny Spearman eo amin'ny famantarana GA, ny hamafin'ny fitomboan'ny ety ambonin'ny tany, ary ny anisotropia fitomboan'ny ety ambonin'ny tany amin'ny ambaratongan'ny sela tsy misy CZ. Ny isa eo ankavanana dia ny sandan'ny Spearman rho eo anelanelan'ny fiovaovana roa. Ny kintana dia manondro tranga izay tena manan-danja ny fifandraisana/fifandraisana ratsy. e Fanehoana an-tsary 3D ny sela Col-0 SAM L1 amin'ny alàlan'ny mikroskopia confocal. Ny rindrin'ny sela vaovao niforona tao amin'ny SAM (fa tsy ny primordium) tamin'ny 10 ora dia nolokoina araka ny sandan'ny zorony. Aseho eo amin'ny zoro ambany havanana ny bara loko. Ny sary kely dia mampiseho ny sary 3D mifandraika amin'izany amin'ny 0 ora. Naverina indroa ny fanandramana ary nitovy ny vokatra. f Ny tetika boaty dia mampiseho ny tahan'ny fizarazarana sela ao amin'ny IPR sy ny tsy IPR Col-0 SAM (n = 10 zavamaniry tsy miankina). Ny tsipika afovoany dia mampiseho ny mediana, ary ny sisin-tany boaty dia manondro ny percentile faha-25 sy faha-75. Ny volombava dia manondro ny sanda kely indrindra sy ambony indrindra voafaritra amin'ny rindrambaiko R. Ny sanda P dia azo tamin'ny fitsapana t roa-rambony an'i Welch. g, h Kisarisary skematika mampiseho (g) ny fomba fandrefesana ny zoro amin'ny rindrin'ny sela vaovao (magenta) raha oharina amin'ny lalana radial avy eo afovoan'ny SAM (tsipika fotsy teboka) (ny sanda zoro maranitra ihany, izany hoe, 0–90°, no raisina), ary (h) ny lalana manodidina/lateral sy radial ao anatin'ny meristem. i Histograma matetika amin'ny fironan'ny fizarazarana sela manerana ny SAM (manga maizina), IPR (manga antonony), ary tsy IPR (manga mazava). Azo tamin'ny alalan'ny fitsapana Kolmogorov-Smirnov roa sosona ny sandan'ny P. Naverina indroa ny fanandramana ary nitovy ny vokatra azo. j Histograma matetika maneho ny fironan'ny fizaran'ny sela IPR manodidina ny P3 (maitso mazava), P4 (maitso antonony), ary P5 (maitso maizina). Azo tamin'ny alalan'ny fitsapana Kolmogorov-Smirnov roa sosona ny sandan'ny P. Naverina indroa ny fanandramana ary nitovy ny vokatra azo.
Noho izany, dia nodinihinay avy eo ny fifandraisana misy eo amin'ny famantarana GA sy ny asan'ny fizarazaran'ny sela amin'ny alàlan'ny famantarana ireo rindrin'ny sela vao niforona nandritra ny fanadihadiana (Sary 5e). Io fomba fiasa io dia namela anay handrefesana ny matetika sy ny lalana izoran'ny fizarazaran'ny sela. Mahagaga fa hitanay fa mitovy ny matetika izoran'ny fizarazaran'ny sela ao amin'ny IPR sy ny ambin'ny SAM (tsy IPR, Sary 5f), izay manondro fa ny fahasamihafan'ny famantarana GA eo amin'ny sela IPR sy tsy IPR dia tsy misy fiantraikany betsaka amin'ny fizarazaran'ny sela. Izany, ary ny fifandraisana tsara eo amin'ny famantarana GA sy ny anisotropy fitomboana, dia nanosika anay handinika raha toa ka mety hisy fiantraikany amin'ny fironan'ny fizarazaran'ny sela ny asan'ny famantarana GA. Norefesinay ho zoro maranitra ny rindrin'ny sela vaovao raha oharina amin'ny axe radial mampitohy ny foibe meristem sy ny afovoan'ny rindrin'ny sela vaovao (Sary 5e-i) ary nahita fironana mazava ho an'ny sela hizara amin'ny zoro akaikin'ny 90° raha oharina amin'ny axe radial, miaraka amin'ny fatran'ny matetika avo indrindra hita amin'ny 70–80° (23.28%) sy 80–90° (22.62%) (Sary 5e,i), mifanaraka amin'ny fizarazaran'ny sela amin'ny lalana manodidina/mihodina (Sary 5h). Mba handinihana ny fandraisan'anjaran'ny famantarana GA amin'ity fitondran-tenan'ny fizarazaran'ny sela ity, dia nodinihinay misaraka ny masontsivana fizarazaran'ny sela ao amin'ny IPR sy ny tsy IPR (Sary 5i). Hitanay fa ny fizarana ny zoro fizarazarana ao amin'ny sela IPR dia tsy mitovy amin'ny an'ny sela tsy IPR na ao amin'ny sela ao amin'ny SAM manontolo, miaraka amin'ny sela IPR izay mampiseho ampahany betsaka kokoa amin'ny fizarana sela lateral/boribory, izany hoe, 70–80° sy 80–90° (33.86% sy 30.71%, tsirairay avy, ampahany mifanaraka amin'izany) (Sary 5i). Noho izany, ny fandinihanay dia naneho fifandraisana misy eo amin'ny famantarana GA avo lenta sy ny fironan'ny sehatra fizarazarana sela akaikin'ny lalana manodidina, mitovy amin'ny fifandraisana misy eo amin'ny asan'ny famantarana GA sy ny anisotropy fitomboana (Sary 5c, d). Mba hanamafisana bebe kokoa ny fiarovana ara-toerana an'io fifandraisana io, dia norefesinay ny fironan'ny sehatra fizarazarana ao amin'ny sela IPR manodidina ny primordium manomboka amin'ny P3, satria ny asan'ny famantarana GA ambony indrindra dia hita tao amin'io faritra io manomboka amin'ny P4 (Sary 4). Ny zoro fizarazarana an'ny IPR manodidina ny P3 sy P4 dia tsy naneho fahasamihafana manan-danja ara-statistika, na dia nitombo aza ny fiparitahan'ny fizarana sela lateral tao amin'ny IPR manodidina ny P4 (Sary 5j). Na izany aza, tao amin'ny sela IPR manodidina ny P5, ny fahasamihafan'ny fironan'ny fizarazarana sela dia nanjary manan-danja ara-statistika, miaraka amin'ny fitomboana tampoka amin'ny fatran'ny fizarazarana sela miampita (Sary 5j). Ireo valiny ireo dia manambara fa ny famantarana GA dia afaka mifehy ny fironan'ny fizarazarana sela ao amin'ny SAM, izay mifanaraka amin'ny tatitra teo aloha40,41 fa ny famantarana GA avo dia mety hiteraka fironan'ny fizarazarana sela amin'ny ilany ao amin'ny IPR.
Voalaza fa tsy ho tafiditra ao amin'ny primordia ny sela ao amin'ny IPR fa ho tafiditra ao amin'ny internodes2,42,43. Ny fiolahana miampita amin'ny fizarazarana sela ao amin'ny IPR dia mety hiteraka fandaminana mahazatra amin'ny andalana lava mifanitsy amin'ny sela epidermal ao amin'ny internodes. Ny fandinihanay voalaza etsy ambony dia manondro fa ny famantarana GA dia mety mitana anjara toerana amin'ity dingana ity amin'ny alàlan'ny fandrindrana ny lalana fizarazarana sela.
Ny fahaverezan'ny asan'ny fototarazo DELLA maromaro dia miteraka valinteny GA tsy miovaova, ary azo ampiasaina hitsapana io petra-kevitra io ny mutants della44. Nodinihinay voalohany ny lamina fanehoana ny fototarazo DELLA dimy ao amin'ny SAM. Ny fampifangaroana ny transcription an'ny tsipika GUS45 dia naneho fa ny GAI, RGA, RGL1, ary RGL2 (amin'ny ambaratonga kely kokoa) dia naseho tao amin'ny SAM (Sary Fanampiny 11a–d). Ny hybridization in situ dia naneho bebe kokoa fa ny GAI mRNA dia miangona manokana ao amin'ny primordia sy ny voninkazo mivoatra (Sary Fanampiny 11e). Ny RGL1 sy RGL3 mRNA dia hita manerana ny SAM canopy sy amin'ny voninkazo efa antitra, raha toa kosa ny RGL2 mRNA dia betsaka kokoa tao amin'ny faritra sisintany (Sary Fanampiny 11f–h). Ny sary confocal an'ny pRGL3::RGL3-GFP SAM dia nanamafy ny fanehoana hita tamin'ny hybridization in situ ary nampiseho fa ny proteinina RGL3 dia miangona ao amin'ny tapany afovoan'ny SAM (Sary Fanampiny 11i). Amin'ny fampiasana ny tsipika pRGA::GFP-RGA, dia hitanay ihany koa fa miangona ao amin'ny SAM ny proteinina RGA, saingy mihena ny habetsahany eo amin'ny sisin-tany manomboka amin'ny P4 (Sary Fanampiny 11j). Tsara homarihina fa ny lamina fanehoana ny RGL3 sy RGA dia mifanaraka amin'ny asa famantarana GA ambony kokoa ao amin'ny IPR, araka ny hitan'ny qmRGA (Sary 4). Ankoatra izany, ireo angon-drakitra ireo dia manondro fa ny DELLA rehetra dia aseho ao amin'ny SAM ary ny fanehoana azy ireo dia mivelatra manerana ny SAM manontolo.
Avy eo dia nodinihinay ireo masontsivana fizarazarana sela ao amin'ny SAM karazana voajanahary (Ler, fanaraha-maso) sy ny gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Sary 6a, b). Mahaliana fa nahita fiovana manan-danja ara-statistika teo amin'ny fizarana ny fatran'ny zoro fizarazarana sela tao amin'ny SAM della global mutant raha oharina amin'ny karazana voajanahary (Sary 6c). Io fiovana eo amin'ny della global mutant io dia vokatry ny fitomboan'ny fatran'ny zoro 80–90° (34.71% vs. 24.55%) ary, amin'ny ambaratonga kely kokoa, zoro 70–80° (23.78% vs. 20.18%), izany hoe, mifanaraka amin'ny fizarazarana sela mivelatra (Sary 6c). Ny fatran'ny fizarazarana tsy mivelatra (0–60°) dia ambany kokoa ihany koa tao amin'ny della global mutant (Sary 6c). Ny fatran'ny fizarazarana sela mivelatra dia nitombo be tao amin'ny SAM an'ny della global mutant (Sary 6b). Avo kokoa ihany koa ny fizaran'ny sela miampita ao amin'ny IPR ao amin'ny della global mutant raha oharina amin'ny karazana voajanahary (Sary 6d). Any ivelan'ny faritra IPR, ny karazana voajanahary dia manana fizarana mitovy kokoa amin'ny zoro fizaran'ny sela, raha toa kosa ny della global mutant dia aleony ny fizarana tangential toy ny IPR (Sary 6e). Nokajianay ihany koa ny fironan'ny fizaran'ny sela ao amin'ny SAM an'ny ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutants (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ary ga2ox6-2), izay fiaviana mutant tsy miasa GA izay iangonan'ny GA. Mifanaraka amin'ny fitomboan'ny haavon'ny GA, ny SAM amin'ny fiforonan'ny ga2ox mutant quintuple dia lehibe kokoa noho ny an'ny Col-0 (Sary Fanampiny 12a, b), ary raha ampitahaina amin'ny Col-0, ny ga2ox SAM quintuple dia naneho fizarana zoro fizarazarana sela miavaka, miaraka amin'ny fitomboan'ny zoro avy amin'ny 50° ka hatramin'ny 90°, izany hoe mankasitraka ny fizarazarana tangential (Sary Fanampiny 12a–c). Noho izany, asehonay fa ny fampandehanana tsy tapaka ny famantarana GA sy ny fanangonan-karena GA dia miteraka fizarazarana sela lateral ao amin'ny IPR sy ny ambin'ny SAM.
a, b Fanehoana an-tsary 3D ny sosona L1 amin'ny Ler (a) sy ny della mutant manerantany (b) SAM amin'ny alalan'ny mikroskopia confocal. Aseho sy miloko araka ny sandan'ny zorony ny rindrin'ny sela vaovao niforona tao amin'ny SAM (fa tsy ny primordium) nandritra ny 10 ora. Ny sary kely dia mampiseho ny SAM amin'ny 0 ora. Aseho eo amin'ny zoro ambany havanana ny bara loko. Ny zana-tsipìka ao amin'ny (b) dia manondro ohatra iray amin'ny rakitra sela mifanaraka amin'ny della mutant manerantany. Naverina indroa ny andrana ary nahazo valiny mitovy. fampitahana ny fizarana matetika ny fironan'ny fizarazarana sela ao amin'ny SAM manontolo (d), IPR (e), ary tsy IPR (f) eo anelanelan'ny Ler sy ny della manerantany. Azo tamin'ny alalan'ny fitsapana Kolmogorov-Smirnov roa rambony ny sandan'ny P. f, g Fanehoana an-tsary 3D ny sary confocal an'ny SAM voaloko PI an'ny zavamaniry transgenic Col-0 (i) sy pCUC2::gai-1-VENUS (j). Ny takelaka (a, b) dia mampiseho rindrin'ny sela vaovao (fa tsy primordia) niforona tao amin'ny SAM tao anatin'ny 10 ora. Naverina indroa ny fanandramana ary nitovy ny vokatra azo. h–j Fampitahana ny fizarazarana matetika ny fironan'ny fizarazarana sela hita ao amin'ny SAM manontolo (h), IPR (i) ary tsy IPR (j) eo anelanelan'ny zavamaniry Col-0 sy pCUC2::gai-1-VENUS. Ny sandan'ny P dia azo tamin'ny fampiasana fitsapana Kolmogorov–Smirnov roa rambony.
Notsapainay avy eo ny vokatry ny fanakanana ny famantarana GA manokana ao amin'ny IPR. Noho izany, nampiasa ny mpandrindra cotyledon cup 2 (CUC2) izahay mba hampiroboroboana ny fanehoana ny proteinina gai-1 ratsy manjaka mifamatotra amin'ny VENUS (ao amin'ny tsipika pCUC2::gai-1-VENUS). Ao amin'ny SAM karazana voajanahary, ny mpandrindra CUC2 no mitarika ny fanehoana ny ankamaroan'ny IPR ao amin'ny SAM, anisan'izany ny sela eo amin'ny sisin-tany, manomboka amin'ny P4, ary hita fa mitovy amin'izany ny fanehoana manokana ao amin'ny zavamaniry pCUC2::gai-1-VENUS (jereo eto ambany). Ny fizarana ny zoro fizarazaran'ny sela manerana ny SAM na IPR an'ny zavamaniry pCUC2::gai-1-VENUS dia tsy dia samy hafa loatra amin'ny an'ny karazana voajanahary, na dia tsy nampoizina aza fa hitanay fa ny sela tsy misy IPR amin'ireo zavamaniry ireo dia mizara amin'ny matetika kokoa 80–90° (Sary 6f–j).
Voalaza fa ny lalan'ny fizarazaran'ny sela dia miankina amin'ny jeometrika ao amin'ny SAM, indrindra ny fihenjanana ateraky ny fiolahana amin'ny sela46. Noho izany dia nanontany izahay raha niova ny endriky ny SAM tao amin'ny zavamaniry della global mutant sy pCUC2::gai-1-VENUS. Araka ny voalaza teo aloha12, ny haben'ny della global mutant SAM dia lehibe kokoa noho ny an'ny karazana voajanahary (Sary Fanampiny 13a, b, d). Ny hybridization in situ an'ny CLV3 sy STM RNA dia nanamafy ny fanitarana ny meristem tao amin'ny della mutants ary naneho bebe kokoa ny fanitarana lateral ny niche sela fototra (Sary Fanampiny 13e, f, h, i). Na izany aza, ny fiolahana SAM dia mitovy amin'ny genotypes roa (Sary Fanampiny 13k, m, n, p). Nahita fitomboana mitovy amin'izany teo amin'ny habeny izahay tao amin'ny gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant tsy nisy fiovan'ny fiolahana raha oharina amin'ny karazana voajanahary (Sary Fanampiny 13c, d, g, j, l, o, p). Ny fatran'ny fizarazarana sela dia nisy fiantraikany ihany koa tamin'ny mutant della quadruple, saingy kely kokoa noho ny tamin'ny mutant della monolithic (Sary Fanampiny 12d–f). Io fiantraikan'ny fatra io, miaraka amin'ny tsy fisian'ny fiantraikany amin'ny fiolahana, dia manondro fa ny asan'ny RGL3 sisa tavela amin'ny mutant Della quadruple dia mametra ny fiovan'ny fizarazarana sela vokatry ny fahaverezan'ny asan'ny DELLA ary ny fiovan'ny fizarazarana sela lateral dia mitranga ho setrin'ny fiovan'ny asan'ny famantarana GA fa tsy ny fiovan'ny jeometrika SAM. Araka ny voalaza etsy ambony, ny mpandrindra CUC2 dia mitarika ny fanehoana IPR ao amin'ny SAM manomboka amin'ny P4 (Sary Fanampiny 14a, b), ary mifanohitra amin'izany, ny pCUC2::gai-1-VENUS SAM dia nanana habe kely kokoa saingy fiolahana ambony kokoa (Sary Fanampiny 14c–h). Io fiovan'ny morphology pCUC2::gai-1-VENUS SAM io dia mety hiteraka fizarana hafa amin'ny fihenjanana mekanika raha oharina amin'ny karazana wild, izay manomboka amin'ny elanelana fohy kokoa avy amin'ny foibe SAM ny fihenjanana manodidina avo lenta47. Raha tsy izany, ny fiovan'ny morphology pCUC2::gai-1-VENUS SAM dia mety ho vokatry ny fiovan'ny toetra mekanika isam-paritra vokatry ny fanehoana transgene48. Amin'ireo tranga roa ireo, dia mety hanonerana ny vokatry ny fiovan'ny famantarana GA amin'ny alàlan'ny fampitomboana ny mety hisian'ny fizarana ny sela amin'ny fironana manodidina/mihodina, izay manazava ny zavatra hitanay.
Raha fintinina, ny angon-drakitray dia manamafy fa ny famantarana GA ambony kokoa dia mitana anjara toerana mavitrika amin'ny fironan'ny lafiny amin'ny sehatry ny fizarazarana sela ao amin'ny IPR. Asehon'izy ireo ihany koa fa ny fiolahana meristem dia misy fiantraikany amin'ny fironan'ny sehatry ny fizarazarana sela ao amin'ny IPR.
Ny fironan'ny fizarazarana miampita amin'ny IPR, noho ny fiasan'ny famantarana GA avo lenta, dia manondro fa ny GA dia mandamina mialoha ny rakitra sela radial ao amin'ny epidermis ao anatin'ny SAM mba hamaritana ny fandaminana sela izay ho hita any aoriana ao amin'ny internode epidermal. Eny tokoa, matetika hita amin'ny sarin'ny SAM an'ny mutants della global ireo rakitra sela ireo (Sary 6b). Noho izany, mba handinihana bebe kokoa ny fiasan'ny fivoaran'ny lamina ara-habakabaka amin'ny famantarana GA ao amin'ny SAM, dia nampiasa sary ara-potoana izahay mba handinihana ny fandaminana ara-habakabaka ny sela ao amin'ny IPR amin'ny zavamaniry transgenic wild-type (Ler sy Col-0), della global mutants, ary pCUC2::gai-1-VENUS.
Hitanay fa ny qmRGA dia naneho fa nitombo avy amin'ny P1/P2 ny asan'ny famantarana GA ao amin'ny IPR ary nahatratra ny fara tampony tamin'ny P4, ary nijanona ho tsy miova io lamina io rehefa mandeha ny fotoana (Sary 4a–f sy Sary Fanampiny 8c–f, k). Mba handinihana ny fandaminana ara-habakabaka ny sela ao amin'ny IPR miaraka amin'ny famantarana GA mitombo, dia nasiana marika ny sela Ler IPR eo ambony sy eo amin'ny sisin'ny P4 araka ny anjaran'ny fivoarany nodinihina 34 ora taorian'ny fandinihana voalohany, izany hoe, mihoatra ny fotoana plastida roa, izay namela anay hanaraka ny sela IPR mandritra ny fivoaran'ny primordium avy amin'ny P1/P2 ka hatramin'ny P4. Nampiasa loko telo samihafa izahay: mavo ho an'ireo sela izay tafiditra ao amin'ny primordium akaikin'ny P4, maitso ho an'ireo izay ao amin'ny IPR, ary volomparasy ho an'ireo izay nandray anjara tamin'ny dingana roa (Sary 7a–c). Tamin'ny t0 (0 h), dia hita teo anoloan'ny P4 ny sosona sela IPR 1–2 (Sary 7a). Araka ny nantenaina, rehefa nizara ireo sela ireo, dia nanao izany indrindra tamin'ny alàlan'ny fiaramanidina fizarana miampita (Sary 7a–c). Nahazoana vokatra mitovy amin'izany ny fampiasana Col-0 SAM (mifantoka amin'ny P3, izay miforitra mitovy amin'ny P4 ao amin'ny Ler), na dia amin'ity genotype ity aza dia manafina haingana kokoa ny sela IPR ny vala niforona teo amin'ny sisin'ny voninkazo (Sary 7g–i). Noho izany, ny lamina fizarazaran'ny sela IPR dia mandamina mialoha ny sela ho andalana radial, toy ny amin'ny internodes. Ny fandaminana ny andalana radial sy ny toerana misy ny sela IPR eo anelanelan'ny taova mifanesy dia manondro fa ireo sela ireo dia razambe internodal.
Eto izahay dia namorona biosensor famantarana GA ratiometric, qmRGA, izay ahafahana mampitaha ny habetsaky ny asa famantarana GA vokatry ny fifantohana GA sy ny mpandray GA mitambatra sady mampihena ny fitsabahana amin'ny lalan'ny famantarana endogenous, ka manome fampahalalana momba ny asan'ny GA amin'ny ambaratonga sela. Noho izany, dia nanamboatra proteinina DELLA novaina izahay, mRGA, izay very ny fahafahana mifamatotra amin'ireo mpiara-miasa amin'ny fifandraisana DELLA saingy mbola mora tohina amin'ny proteolysis vokatry ny GA. Ny qmRGA dia mamaly ny fiovana exogenous sy endogenous amin'ny haavon'ny GA, ary ny toetrany mavitrika dia ahafahana manombana ny fiovana spatiotemporal amin'ny asa famantarana GA mandritra ny fivoarana. Ny qmRGA koa dia fitaovana tena mora ampiasaina satria azo ampifanarahana amin'ny sela samihafa amin'ny alàlan'ny fanovana ny promoter ampiasaina amin'ny fanehoana azy (raha ilaina), ary noho ny toetra voatahiry amin'ny lalan'ny famantarana GA sy ny motif PFYRE amin'ny angiosperms, dia azo inoana fa azo afindra amin'ny karazana hafa izany22. Mifanaraka amin'izany, ny fiovan'ny fototarazo mitovy amin'ny proteinina vary SLR1 DELLA (HYY497AAA) dia naseho ihany koa fa manakana ny asan'ny SLR1 amin'ny fampihenana ny fitomboan'ny sela sady mampihena kely fotsiny ny fahasimbany vokatry ny GA, mitovy amin'ny mRGA23. Tsara homarihina fa ny fanadihadiana vao haingana tao amin'ny Arabidopsis dia naneho fa ny fiovan'ny asidra amine tokana ao amin'ny sehatra PFYRE (S474L) dia nanova ny asan'ny fandikana ny RGA tsy misy fiantraikany amin'ny fahafahany mifandray amin'ireo mpiara-miasa amin'ny singa fandikana50. Na dia akaiky dia akaiky ny fanoloana asidra amine 3 misy ao amin'ny mRGA aza ity fiovan'ny fototarazo ity, ny fanadihadianay dia mampiseho fa ireo fiovan'ny fototarazo roa ireo dia manova ny toetra mampiavaka ny DELLA. Na dia mifamatotra amin'ny sehatra LHR1 sy SAW an'ny DELLA26,51 aza ny ankamaroan'ny mpiara-miasa amin'ny singa fandikana, ny asidra amine voatahiry ao amin'ny sehatra PFYRE dia mety hanampy amin'ny fanamafisana ireo fifandraisana ireo.
Ny fivoaran'ny internode dia toetra fototra amin'ny maritrano sy ny fanatsarana ny vokatra. Ny qmRGA dia naneho ny fiasan'ny famantarana GA ambony kokoa ao amin'ny sela razamben'ny internode IPR. Amin'ny alàlan'ny fampifangaroana ny sary quantitative sy ny génétique, dia nasehonay fa ny lamina famantarana GA dia mametraka sehatra fizarana sela boribory/transverse ao amin'ny epidermis SAM, izay mamolavola ny fandaminana ny fizarana sela ilaina amin'ny fivoaran'ny internode. Mpandrindra maromaro amin'ny fironan'ny sehatra fizarana sela no voafaritra nandritra ny fivoarana52,53. Ny asanay dia manome ohatra mazava momba ny fomba fandrindran'ny asan'ny famantarana GA ity paramètre sela ity. Ny DELLA dia afaka mifandray amin'ny complexes proteinina prefolding41, ka ny famantarana GA dia mety handrindra ny fironan'ny sehatra fizarana sela amin'ny alàlan'ny fiantraikany mivantana amin'ny fironan'ny microtubule cortical40,41,54,55. Nasehonay tsy nampoizina fa ao amin'ny SAM, ny fifandraisana amin'ny asan'ny famantarana GA ambony kokoa dia tsy ny elongation na ny fizarana sela, fa ny anisotropy fitomboana fotsiny, izay mifanaraka amin'ny fiantraikan'ny GA mivantana amin'ny lalana fizarana sela ao amin'ny IPR. Na izany aza, tsy afaka manilika izahay fa mety ho ankolaka ihany koa io fiantraikany io, ohatra, vokatry ny fanalefahana ny rindrin'ny sela vokatry ny GA56. Ny fiovan'ny toetran'ny rindrin'ny sela dia miteraka fihenjanana mekanika57,58, izay mety hisy fiantraikany amin'ny fironan'ny fizarazarana sela amin'ny alàlan'ny fiantraikany amin'ny fironan'ny microtubules cortical39,46,59. Ny fiantraikan'ny fihenjanana mekanika ateraky ny GA sy ny fanaraha-maso mivantana ny fironan'ny microtubules ataon'ny GA dia mety ho tafiditra amin'ny famoronana lamina manokana amin'ny fironan'ny fizarazarana sela ao amin'ny IPR mba hamaritana ireo internodes, ary ilaina ny fanadihadiana fanampiny mba hitsapana izany hevitra izany. Toy izany koa, ny fanadihadiana teo aloha dia nanasongadina ny maha-zava-dehibe ny proteinina TCP14 sy 15 mifandray amin'ny DELLA amin'ny fanaraha-maso ny fiforonan'ny internode60,61 ary ireo anton-javatra ireo dia mety hanelanelana ny fiasan'ny GA miaraka amin'ny BREVIPEDICELLUS (BP) sy PENNYWISE (PNY), izay mandrindra ny fivoaran'ny internode ary naseho fa misy fiantraikany amin'ny famantarana GA2,62. Koa satria mifandray amin'ny lalan'ny famantarana brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, ary abscisic acid (ABA) ny DELLAs63,64 ary mety hisy fiantraikany amin'ny fironan'ny microtubule ireo hormonina ireo65, dia mety ho vokatry ny hormonina hafa koa ny fiantraikan'ny GA amin'ny fironan'ny fizarazaran'ny sela.
Ny fanadihadiana sitolojika voalohany dia naneho fa na ny faritra anatiny na ny faritra ivelany amin'ny Arabidopsis SAM dia ilaina amin'ny fivoaran'ny internode2,42. Ny zava-misy fa ny GA dia mandrindra mavitrika ny fizarazaran'ny sela ao amin'ny sela anatiny12 dia manohana ny asan'ny GA roa sosona amin'ny fandrindrana ny haben'ny meristem sy ny internode ao amin'ny SAM. Ny lamina fizarazarana sela mivantana dia fehezina mafy ihany koa ao amin'ny sela anatiny SAM, ary io fitsipika io dia tena ilaina amin'ny fitomboan'ny tahony52. Ho mahaliana ny mandinika raha toa ka mitana anjara toerana amin'ny fandaminana ny sehatry ny fizarazarana sela ao amin'ny fandaminana anatiny SAM ihany koa ny GA, ka mampifanaraka ny famaritana sy ny fivoaran'ny internodes ao anatin'ny SAM.
Novolena in vitro tao anaty tany na fitaovana Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) nasiana siramamy 1% sy agar 1% (Sigma) teo ambanin'ny fepetra mahazatra (hazavana 16 ora, 22 °C), afa-tsy ny andrana hypocotyl sy ny fitomboan'ny faka izay nambolena zana-kazo teo amin'ny takelaka mitsangana teo ambanin'ny hazavana tsy tapaka sy 22 °C. Ho an'ny andrana nitrate, dia nambolena tamin'ny fitaovana MS novaina (fitaovana zavamaniry bioWORLD) nasiana nitrate sahaza (0 na 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, siramamy 1% ary A-agar 1% (Sigma) teo ambanin'ny fepetra maharitra andro ny zavamaniry.
Ny cDNA GID1a nampidirina tao amin'ny pDONR221 dia natambatra indray tamin'ny pDONR P4-P1R-pUBQ10 sy pDONR P2R-P3-mCherry tao amin'ny pB7m34GW mba hamoronana pUBQ10::GID1a-mCherry. Ny ADN IDD2 nampidirina tao amin'ny pDONR221 dia natambatra indray tao amin'ny pB7RWG266 mba hamoronana p35S:IDD2-RFP. Mba hamoronana pGID1b::2xmTQ2-GID1b, dia nohamafisina voalohany tamin'ny fampiasana ireo primer ao amin'ny Tabilao Fanampiny 3 ny sombin-javatra 3.9 kb eo ambonin'ny faritra fandikana GID1b sy ny sombin-javatra 4.7 kb misy ny cDNA GID1b (1.3 kb) sy ny terminator (3.4 kb) ary avy eo nampidirina tao amin'ny pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) sy pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), ary farany dia natambatra indray tamin'ny pDONR221 2xmTQ268 tao amin'ny vector kendrena pGreen 012567 tamin'ny fampiasana ny Gateway cloning. Mba hamoronana ny pCUC2::LSSmOrange, ny filaharan'ny mpandrindra CUC2 (3229 bp eo ambonin'ny ATG) arahin'ny filaharan'ny kaody an'ny mOrange lehibe Stokes-shifted (LSSmOrange)69 miaraka amin'ny famantarana toerana nokleary N7 sy ny terminator fandikana NOS dia natambatra tao amin'ny vector targeting pGreen kanamycin amin'ny alàlan'ny rafitra recombination Gateway 3-fragment (Invitrogen). Ny vector binary zavamaniry dia nampidirina tao amin'ny karazana Agrobacterium tumefaciens GV3101 ary nampidirina tao amin'ny ravin'ny Nicotiana benthamiana tamin'ny alàlan'ny fomba infiltration Agrobacterium ary tao amin'ny Arabidopsis thaliana Col-0 tamin'ny alàlan'ny fomba floral dip. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry sy pCLV3::mCherry-NLS qmRGA dia navahana avy amin'ny taranaka F3 sy F1 amin'ny cross-series tsirairay avy.
Natao tamin'ny tendron'ny tsimoka mirefy 1 sm eo ho eo ny hybridization RNA in situ72, izay nangonina ary naraikitra avy hatrany tao anaty vahaolana FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) izay efa nangatsiaka mialoha hatramin'ny 4 °C. Rehefa avy notsaboina tamin'ny banga nandritra ny 2 × 15 minitra, dia novaina ny fixative ary notehirizina nandritra ny alina ny santionany. Ny cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, ary RGL3 ary ny probes antisense amin'ny 3′-UTR dia novokarina tamin'ny fampiasana ny primer aseho ao amin'ny Tabilao Fanampiny 3 araka ny voalazan'i Rosier et al.73. Nojerena ny hery fiarovana tamin'ny alalan'ny fampiasana antibody digoxigenin (fanalefahana 3000 heny; Roche, laharan'ny katalaogy: 11 093 274 910) ireo probe misy marika digoxigenin, ary nolokoina tamin'ny vahaolana 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, fanalefahana 250 heny)/nitroblue tetrazolium (NBT, fanalefahana 200 heny) ireo fizarana.
Fotoana fandefasana: 10 Febroary 2025