Ny fanafody anthelmintika N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) dia voalaza fa manakana ny AChE (acetylcholinesterase) ary mety manana toetra mety hiteraka homamiadana noho ny vascularization tafahoatra. Ato amin'ity lahatsoratra ity, dia asehonay fa ny DEET dia mandrisika manokana ny sela endothelial izay mampiroborobo ny angiogenesis, ka mampitombo ny fitomboan'ny fivontosana. Ny DEET dia mampihetsika ny fizotran'ny sela izay mitarika amin'ny angiogenesis, anisan'izany ny fihanaky ny sela, ny fifindra-monina ary ny adhesion. Izany dia mifandray amin'ny fitomboan'ny famokarana NO sy ny fanehoana VEGF ao amin'ny sela endothelial. Ny fampanginana ny M3 na ny fampiasana inhibitors M3 pharmacological dia manafoana ireo fiantraikany rehetra ireo, izay manondro fa ny angiogenesis vokatry ny DEET dia mora tohina amin'ny M3. Ny fanandramana nahitana famantarana kalsioma ao amin'ny sela endothelial sy HEK izay maneho tafahoatra ny receptors M3, ary koa ny fandalinana ny fifamatorana sy ny docking, dia manondro fa ny DEET dia miasa toy ny modulator allosteric an'ny receptors M3. Ankoatra izany, ny DEET dia manakana ny AChE, ka mampitombo ny bioavailability ny acetylcholine sy ny fifamatorany amin'ny receptors M3, ary mampitombo ny fiantraikany proangiogenic amin'ny alàlan'ny regulation allosteric.
Nalaina avy amin'ny aorta-n'ny totozy soisa ny EC voalohany. Ny fomba fanesorana dia nalaina avy amin'ny protokol Kobayashi 26. Ny EC Murine dia novolena tao anaty fitaovana EBM-2 izay nampiana FBS tsy miasa amin'ny hafanana 5% mandra-pahatongan'ny fizarana fahefatra.
Nodinihina tamin'ny alalan'ny CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) ny fiantraikan'ny fifantohana DEET roa amin'ny fihanaky ny HUVEC, U87MG, na BF16F10. Raha fintinina, sela 5.103 isaky ny lavaka no nafafy tao anaty takelaka misy lavaka 96, navela hiraikitra nandritra ny alina, ary avy eo notsaboina tamin'ny DEET nandritra ny 24 ora. Rehefa nesorina ny fitaovana fitomboana, dia ampio vahaolana mampiraikitra loko amin'ny lavaka tsirairay amin'ny takelaka kely ary ampangatsiaho amin'ny 37 °C mandritra ny 30 minitra ny sela. Ny haavon'ny fluorescence dia voafaritra tamin'ny alalan'ny mpamaky takelaka kely Mithras LB940 multimode (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemaina) izay misy sivana excitation 485 nm sy sivana emission 530 nm.
Nafafy tao anaty takelaka misy lavaka 96 ny HUVEC tamin'ny hakitroky ny sela 104 isaky ny lavaka. Notsaboina tamin'ny DEET nandritra ny 24 ora ny sela. Nodinihina tamin'ny alalan'ny fampiasana MTT assay colorimetric (Sigma-Aldrich, M5655) ny fahaveloman'ny sela. Azo tamin'ny alalan'ny mpamaky takelaka mikrôfôna multimode (Mithras LB940) tamin'ny halavan'ny onjam-peo 570 nm ny sandan'ny hakitroky optika.
Nodinihina tamin'ny alalan'ny fanadihadiana angiogenesis in vitro ny vokatry ny DEET. Ny fitsaboana amin'ny 10-8 M na 10-5 M DEET dia nampitombo ny fiforonan'ny halavan'ny kapilary tao amin'ny HUVEC (Sary 1a, b, tsipika fotsy). Raha ampitahaina amin'ny vondrona fanaraha-maso, ny fitsaboana amin'ny fifantohana DEET manomboka amin'ny 10-14 ka hatramin'ny 10-5 M dia naneho fa nahatratra ny haavony ny halavan'ny kapilary tamin'ny 10-8 M DEET (Sary Fanampiny S2). Tsy nisy fahasamihafana manan-danja hita teo amin'ny fiantraikany proangiogenic in vitro an'ny HUVEC notsaboina tamin'ny DEET tao amin'ny elanelan'ny fifantohana 10-8 M sy 10-5 M.
Mba hamaritana ny fiantraikan'ny DEET amin'ny neovaskularization, dia nanao fanadihadiana momba ny neovaskularization in vivo izahay. Rehefa afaka 14 andro, ireo totozy notsindronina sela endothelial izay novolena mialoha tamin'ny 10-8 M na 10-5 M DEET dia naneho fitomboana be teo amin'ny votoatin'ny hemoglobinina (Sary 1c, tsipika fotsy).
Ankoatra izany, nodinihina tamin'ny totozy U87MG mitondra xenograft ny neovascularization vokatry ny DEET izay notsindronina isan'andro (ip) tamin'ny fatra fantatra fa miteraka fifantohana plasma 10-5 M, izay ara-dalàna amin'ny olombelona tratran'ny aretina. tamin'ny 23. Hita ny fivontosana hita (izany hoe fivontosana >100 mm3) 14 andro taorian'ny tsindronina sela U87MG tamin'ny totozy. Tamin'ny andro faha-28, nihamafy be ny fitomboan'ny fivontosana tamin'ny totozy notsaboina DEET raha oharina amin'ny totozy fanaraha-maso (Sary 1d, efamira). Ankoatra izany, ny fandokoana CD31 ny fivontosana dia naneho fa ny DEET dia nampitombo be ny velaran'ny kapila fa tsy ny hakitroky ny lalan-dra madinika. (Sary 1e–g).
Mba hamaritana ny anjara asan'ny mpandray muscarinic amin'ny fihanaky ny DETA, dia nampiasaina ny 10-8 M na 10-5 M DETA teo anatrehan'ny pFHHSiD (10-7 M, mpanohitra ny mpandray M3 voafantina). Fitsaboana ny HUVEC. Nanakana tanteraka ny toetran'ny fihanaky ny DETA amin'ny fifantohana rehetra ny pFHHSiD (Tabilao 1).
Tao anatin'ireo fepetra ireo, dia nodinihinay ihany koa raha toa ka hampitombo ny halavan'ny kapila ao amin'ny sela HUVEC ny DEET. Toy izany koa, ny pFHHSiD dia nisakana be dia be ny halavan'ny kapila vokatry ny DEET (Sary 1a, b, bara volondavenona). Ankoatra izany, dia nisy andrana mitovy amin'izany natao tamin'ny siRNA M3. Na dia tsy nahomby tamin'ny fampiroboroboana ny fiforonan'ny kapila aza ny siRNA fanaraha-maso, ny fampanginana ny mpandray muscarinic M3 dia nanafoana ny fahafahan'ny DEET hampitombo ny halavan'ny kapila (Sary 1a, b, bara mainty).
Ankoatra izany, samy voasakan'ny pFHHSiD tanteraka ny vascularization in vitro vokatry ny 10-8 M na 10-5 M DEET sy ny neovascularization in vivo (Sary 1c, d, faribolana). Ireo valiny ireo dia manondro fa ny DEET dia mampiroborobo ny angiogenesis amin'ny alàlan'ny lalana mora tohina amin'ny antagonista receptor M3 voafantina na M3 siRNA.
Ny AChE no lasibatra molekiolan'ny DEET. Ny fanafody toy ny donepezil, izay miasa toy ny mpanakana ny AChE, dia afaka mandrisika ny angiogenesis EC in vitro sy amin'ny modely ischemia hindlimb totozy14. Notsapainay ny fiantraikan'ny fifantohana roa amin'ny DEET amin'ny asan'ny anzima AChE ao amin'ny HUVEC. Ny fifantohana ambany (10-8 M) sy avo (10-5 M) amin'ny DEET dia nampihena ny asan'ny endothelial AChE raha oharina amin'ny fepetra fanaraha-maso (Sary 2).
Samy nampihena ny asan'ny acetylcholinesterase tao amin'ny HUVEC ny fifantohan'ny DEET (10-8 M sy 10-5 M). Nampiasaina ho fanaraha-maso ho an'ny mpanakana ny acetylcholinesterase ny BW284c51 (10-5 M). Ny valiny dia aseho ho isan-jaton'ny asan'ny AChE ao amin'ny HUVEC izay notsaboina tamin'ny fifantohan'ny DEET roa raha oharina amin'ny sela notsaboina tamin'ny fiara. Ny sanda dia aseho ho salan'isa ± SEM amin'ny andrana enina mahaleo tena. *p < 0.05 raha oharina amin'ny fanaraha-maso (fitsapana fampitahana marobe Kruskal-Wallis sy Dunn).
Ny oksida azota (NO) dia tafiditra amin'ny fizotran'ny angiogenesis 33, noho izany, nodinihina ny famokarana NO ao amin'ny HUVEC voatsindrin'ny DEET. Nitombo ny famokarana NO endothelial notsaboina tamin'ny DEET raha oharina amin'ny sela fanaraha-maso, saingy nahatratra ny lanjany tamin'ny fatra 10-8 M ihany (Sary 3c). Mba hamaritana ny fiovan'ny molekiola mifehy ny famokarana NO vokatry ny DEET, dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny Western blotting ny fanehoana sy ny fampahavitrihana ny eNOS. Na dia tsy nanova ny fanehoana ny eNOS aza ny fitsaboana DEET, dia nampitombo be ny phosphorylation eNOS tao amin'ny toerana fampahavitrihana azy (Ser-1177) sady nampihena ny toerana manakana azy (Thr-495) raha oharina amin'ny sela tsy voatsabo ao amin'ny phosphorylation eNOS (Sary 3d). Ankoatra izany, ny tahan'ny eNOS voafosforily ao amin'ny toerana fampahavitrihana sy ny toerana manakana dia nokajiana taorian'ny nanatsarana ny habetsaky ny eNOS voafosforily amin'ny habetsahan'ny anzima manontolo. Nitombo be io tahan'ny io tao amin'ny HUVEC notsaboina tamin'ny fifantohana DEET tsirairay raha oharina amin'ny sela tsy voatsabo (Sary 3d).
Farany, nohadihadiana tamin'ny alalan'ny Western blotting ny fanehoana ny VEGF, iray amin'ireo anton-javatra lehibe mahatonga ny angiogenesis. Nampitombo be ny fanehoana ny VEGF ny DEET, raha nanakana tanteraka io fanehoana io kosa ny pFHHSiD.
Koa satria mora tohina amin'ny sakana ara-panafody sy ny fihenan'ny mpandray M3 ny vokatry ny DEET, dia notsapainay ny petra-kevitra fa mety hampitombo ny famantarana kalsioma ny DEET. Mahagaga fa tsy nahavita nampitombo ny kalsioma cytoplasmika tao amin'ny HUVEC (tsy aseho ny angon-drakitra) sy HEK/M3 (Sary 4a, b) ny DEET ho an'ny fifantohana roa nampiasaina.
Fotoana fandefasana: 30 Desambra 2024